免疫组织化学在病理研究中的应用.ppt

免 疫 组 织 化 学在 病 理 研 究 中 的 应 用 一.免疫组化的发展 二.免疫组织化学的原理和常用方法 三.免疫组织化学染色的基本技术及注意事项 四.免疫组织化学在病理学中的应用 近半个世纪尤其是近二十多年来有关新方法、新技术的发展和细胞生物学、分子生物学、现代免疫学、遗传学的兴起和发展，对医学、病理学的发展产生了深刻影响。免疫组织化学正是在这种情况下建立发展起来的。 二. 免疫组织化学的应用原理、方法 (一) 概念： 应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成份进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry）或免疫细胞化学(immunocytochemistry). (二) 原理: 1． 抗原（antigen ） I. 概念 是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。 抗原决定簇： 指抗原分子表面有一小部分具有化学活性 基团的区域。它决定了抗原的特异性。 每一种抗原决定簇均可刺激机体产生一种 特异性的抗体，目前已广泛应用单克隆抗体，对抗原进行特异性的标记。 II. 种类 免疫原性与免疫反应性: 完全抗原 、不完全抗原 抗原的化学结构: 蛋白质抗原：血清蛋白质、细胞膜蛋白、酶、受体、多肽类激素、骨架蛋白、生长因子 多糖抗原、核酸抗原、低分子量物质抗原、合成多肽抗原 抗原的分布 结构抗原:血清抗原、膜抗原、骨架蛋白 分泌抗原:酶、激素、受体 入侵抗原、沉积抗原 2． 抗体（antibody） I. 概念 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞,特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。 II. 种类： 多克隆抗体（polyclonal antibody） 特点：多用免疫兔、鸡、羊、马等产生，针对多个抗原决定簇，价廉，效价高。 单克隆抗体(monoclonal antibody McAb) 特点：由杂交瘤细胞产生，针对某一抗原决定簇，特异性和均一性强，可连续大量生产。 基因工程抗体：用DNA重组技术生产。 3.原理： 组织或细胞内的某种化学物质（待检测物） 抗原 免疫动物 抗体 检测（免疫组织化学） 荧光素 酶 金、银颗粒 4.免疫组织化学的优点： 特异性强，灵敏度高，操作简便、三位一体（形态、功能、机制），定性、定位、定量。 荧光素：能够产生明亮荧光的染料物质。 异硫氰酸荧光素： 黄绿色荧光 四乙基罗达明： 橙黄色 四甲基异硫氰酸罗达明：橙黄色 立即在荧光显微镜下观察并显微摄影。每次使用以1－2h为宜。荧光显微镜使用的光源是高压钨灯或高压汞灯，用其发出的蓝紫光或紫外光作为激发光。 2． 免疫酶组织化学技术 60年代初：Nakane、 Avrameas等－－酶标抗体新技术； 70年代初：Sternberger－－非标记抗体酶法及PAP法； II. 方法： 直接法 间接法 酶桥法 过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP)、双PAP法 3． 亲和免疫组织化学方法 I. 原理： 激素─受体，植物凝集素─糖类，葡萄球菌A蛋白─IgG，抗生物素─生物素 利用不同物质之间的高度亲和性，将酶等标记物连接到抗原抗体复合物上，以对体内抗原或抗体进行检测。 .生物素──抗生物素系统 特点: 抗生物素(avidin A): 68KDa。 生物素(biotin B): 244Da。 A、B能与多种示踪剂（如荧光素、胶体金、过氧化物酶等）相结合。 II. 方法 标记抗生物素－生物素(LAB) 技术： Ag*生物素化的抗体*酶标记抗生物素 桥式抗生物素－生物素（BAB) 技术：Ag*生物素化抗体*抗生物素*生物素化酶 抗生物素－生物素－过氧化物酶复合物 (ABC)技术 ： Ag*一抗*生物素化二抗*抗生物素*生物素化酶 链酶菌抗生物素蛋白─过氧化物酶法(SP)： Ag*一抗*生物素化二抗*链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶 ? 4． 免疫胶体金技术 概念： 应用胶体金标记抗体检测抗原。 原理： 胶体金是金的水溶胶 制备胶体金： 免疫金探针的制备：胶体金标记蛋白质的过程，实际上是蛋白质在等电点或稍偏碱性时，被吸附于胶体金颗粒表面。 免疫金探针的纯化、质量鉴定 Ⅰ.免疫金染色法（IGS法）： 直接法： 间接法： 特点：直接与间