Neon 细胞电转仪中文说明书(MPK5000).docx

一，简单的3步骤程序。 1.将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA，RNA，siRNA）的混合物加入到提取物中。 2.将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中; 在设备上选择程序，然后按开始。 3.拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。 注：1. 为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA / siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液 2. 为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次 二，软件操作程序 1.按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon?设备。 本机检查确保Neon?移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。 2.按Voltage启动数字键盘输入电压值。 按所需的电压值，然后按Done保存该值。 注意：如果任何输入值超出限制，则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。 3.按Width激活数字键盘输入宽度值。 按所需的宽度值，然后按Done保存该值。 4. 按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。 按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。 5. 如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。 6. 按所需的程序号码编辑程序。 选定的程序会突出显示。 7. 显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。 光标自动移动到下一个字段协议，并突出显示为红色。继续输入Voltage，Width和Pulses信息。 8。按Enter键将信息保存在数据库中。 9. 继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座 三，细胞与DNA混合物准备 注意事项： 1. 将纯化的DNA重悬于1-5μg/μL浓度的去离子水或TE缓冲液（10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0）中。 浓度可能因细胞类型而异。 2. DNA量不应超过使用总体积的10％。 3. 通过测量A 260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。 电穿孔的比例应至少为1.8。 4. 该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。 使用大于20 kb的质粒很可能降低转染效率。 5. 不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。 通过乙醇沉淀的浓缩DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。 6. 不含Ca2 +和Mg2 +的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页） 流程： 1. 用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon?Tip和Buffer E2，100μLNeon?Tip）填充电转杯。（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。） 2. 将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。 确保Neon?管的侧面电极与Neon?移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置） 3. 在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90％汇合。 4. 对于大多数优化协议，每10μLNeon?Tip可提供5×104-2×105个细胞。（5×105-2×106个细胞每100μLNeon?Tip适用于大多数优化的方案。） 5. 将含有血清，PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）和胰蛋白酶/ EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37℃。从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）冲洗细胞。使用胰蛋白酶/ EDTA或TrypLE Express（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。将细胞转移到1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400×g离心细胞5分钟。通过在室温下以100-400×g离心5分钟，用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）清洗细胞。吸出PBS并以1.0×10 7个细胞/ mL的最终密度将细胞沉淀重悬于Resuspension Buffer R中。 轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。 可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。 6. 通过用含有血清和补充剂的0.5mL培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37℃/ 5％CO 2培养箱中预培养板。 如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。 7. 对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。 使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液 8. 使用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon?Tip和缓冲液E2，100μLNeon?Tip）装入Neon?移液管 9. 根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件 10. 将适量的质粒DNA / siRNA转移到无菌的1