贵州茅台酒与肝癌发生的相关性及对大鼠肝药酶的影响-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2014 届博士研究生论文 2 2 贵州茅台酒与肝癌发生的相关性及对大鼠肝药酶的影响 病理学与病理生理学研究生：赵雪珂 导师：程明亮教授 摘 要 目的：1. 探讨饮用贵州茅台酒（以下简称茅台酒）与原发性肝细胞癌（HCC） 发生的相关性，通过回顾性人群病例对照研究，以比值比（OR）表示相对危险 度，探索饮用茅台酒与 HCC 的发生是否具有统计学联系。 2. 探讨茅台酒对复合因素所致肝癌大鼠肝组织 P53 基因突变的影响。 3. 探讨茅台酒对大鼠酒精代谢相关酶中乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶 （ALDH）、细胞色素 P 450 2E1（CYP2E1）的影响。 方法：第一部分 1. 人群选择 2010 年 12 月到 2011 年 12 月在贵阳医学院附属医院、遵义医 学院附属医院、贵州省肿瘤医院、茅台酒厂职工医院及各地州市医院等 9 家单位 就诊的 HCC 患者及相应住地人群开展相关流行病学调查。 2. HCC 入选病例的诊断方法：参照中国抗癌协会关于 HCC 的最新诊断标准 [1]。排除标准：转移性肝癌、炎性假瘤、自身免疫性肝病、遗传性肝病等影响因 素。 3. 饮酒暴露因素标准：饮酒定义为每周饮酒两次以上,时间超过 1 年[2]。饮 用茅台酒组划分为完全饮用或非完全饮用。 4. 病例组与对照组的比较方法：采用成组病例对照研究。 5. 问卷调查、体格检查和实验室检查：所有测量均由专业医护人员按统一 的规范进行。 6. 记录并且整理相关调查数据。 7. 数据录入 SPSS 16.0 软件进行统计学分析：卡方检验、分层分析、单因素 非条件 Logistic 回归分析；将单因素分析有意义的自变量带入多因素 Logistic 回 归模型，调整混杂因素，计算饮用茅台酒的 OR 值，探讨饮用茅台酒与 HCC 发 生的相关性。 3 3 方法：第二部分 1. 动物模型的建立：以大鼠为实验模型，取雄性 Wistar 大鼠 130 只，适应 性喂养 1 周后，随机取 10 只作为正常对照组（A 组），余大鼠随机平均分为四 组（每组 30 只），茅台酒低剂量组（B 组）和高剂量组（C 组），普通白酒低 剂量组（D 组）和高剂量组（E 组）。低剂量组剂量为 5ml/kg，高剂量组剂量为 10ml/kg，每天早上灌胃一次（5d/w），相同饲料喂养，饮水自由。24w 末参照 文献[3,4]进行肝癌短期造模。黄曲霉素 B1（AFB1）腹腔注射，400μg/kg/次，一 次/d，6 次/w，连续 2w。停用 AFB1 2w 后，换饲含 0.015%二乙酰氨基芴(AAF) 的饲料 2w。灌胃 8w、16w、24w 末各组随机选取 2 只大鼠处死，留取血清及肝 脏,肝脏称重后取一部分新鲜肝组织置于-80℃冻存备用，另一部分以 4%甲醛溶 液固定，常规石蜡切片及 HE 染色。短期造模后处死余下大鼠，标本处理同前。 2. 检测指标： 2.1 肝脏病理学检查 常规苏木素-伊红（HE）染色，选取石蜡包埋的肝组织 蜡块，切片并进行 HE 染色，观测肝脏的病理组织学改变，本部分由贵阳医学院 病理学教研室协助完成。 2.2 结缔组织染色 采用 Masson 三色法，观察肝组织内胶原纤维沉积程度， 本部分由贵阳医学院病理学教研室协助完成。 2.3 血清学检测 透明质酸（HA）、Ⅳ型胶原（ColⅣ）定量测定（化学发光 法）。 2.4 P53 基因的突变检测 2.4.1 提取肝组织 DNA 按照试剂盒说明书进行。 2.4.2 引物设计 本部分由北京鼎国生物技术有限公司合成。 2.4.3 P53 基因变异的直接测序 本部分由北京鼎国生物技术有限公司合成。 方法：第三部分 1. 动物模型的建立：（1）以大鼠为实验模型，取 75 只雄性 Wistar 大鼠随 机分为空白对照组（A 组）、乙醇组（5 ml/kg，B 组，乙醇用蒸馏水稀释至 530 g/L 浓度）、白酒高剂量组（10 ml/kg，C 组）、白酒中剂量组（5 ml/kg，D 组）、 白酒低剂量组（2.5 ml/kg，E 组），每组 15 只。白酒组及乙醇组再以蒸馏水稀 PAGE PAGE 4 释 1 倍灌胃，空白对照组以蒸馏水灌胃（5 ml/kg），1 次/d，共 7 d。全部大鼠 于末次灌胃 1 h 和 12 h 后眼眶采血[5]，然后股动脉放血处死，常规留取血清，并 且留取全部肝脏，肝脏称重后取一部分新鲜肝脏置于-80℃冻存备用，另一部分 以 4%甲醛溶液固定。 （2）雄性 Wistar 大鼠 40 只，随机分为空白对照组 （10ml·kg-1，A 组，10 只）、茅台酒组（10ml·kg-1，B 组,15 只）、乙醇组 （10ml·kg-1,C 组，15 只，乙