光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为视网膜样细胞的分析-眼科学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 4 光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干 细胞分化为视网膜样细胞的研究 硕士研究生： 白月 导 师： 徐国兴 教授 摘 要 目的：研究应用 SD（Sprague-Dawley）大鼠视网膜片光损伤后的培养上清 液，诱导 SD 大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在体外跨胚 层诱导为视网膜样细胞的可能性。 方法：1、SD 大鼠 MSCs 的分离和培养：采用贴壁筛选法分离、培养 SD 大鼠 MSCs，并用流式细胞仪对细胞纯度进行鉴定。2、SD 大鼠视网膜片的取材：在显 微镜下，彻底取下 SD 大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片。并对其常规石蜡切 片 HE 染色鉴定各层组织结构的完整性。3、视网膜片光损伤：在超净台内，将取 下的 SD 大鼠视网膜片放入盛有 Neurobasal 培养基 A（其中加入 1:50 的 B27 和 0.5M L-glutamine）中，用（1950 ±200) Lux 的光照强度照射 45min，用电镜观 察其光损伤程度。4、大鼠 MSCs 诱导分化的条件培养液制备：条件培养液Ⅰ：将 SD 大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液与 10%FBS 的 LG-DMEM 以 2：3 混合而成。 条件培养液Ⅱ：未光损伤 SD 大鼠视网膜片培养的上清液与 10%FBS 的 LG-DMEM 以 2：3 混合而成。条件培养液Ⅲ：直接用 Neurobasal 培养基A与 10%FBS 的 LG-DMEM 以 2:3 混合制成。5、大鼠 MSCs 体外诱导成视网膜样细胞：3 种条件 培养液均培养诱导至第 3 代的 SD 大鼠骨髓间充质干细胞 7-8d。用倒置相差显微 镜观察诱导后细胞形态学改变。6、用免疫细胞化学染色和 RT-PCR 检测视紫红质 （Rhodopsin）、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NES)、胶质纤维 酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP)等特征性标记在诱导后细胞中的表 达情况。 结果：1、流式细胞仪鉴定经贴壁筛选法可获得大量高纯度的大鼠 MSCs。2、 HE 染色显示所取的 SD 大鼠神经上皮层结构完整。3、电镜结果显示光损伤后的 SD 大鼠视网膜片结构损伤严重。4、诱导 7-8d 后的 SD 大鼠 MSCs 置倒置相差 显微镜下观察：条件培养液Ⅰ诱导组的细胞有较多突起，发生迁移并建立突触联 系，而条件培养液Ⅱ及条件培养液Ⅲ只有少数细胞发生上述改变。5、免疫细胞 化学染色显示：3 组不同检测指标阳性率分别为：条件培养液Ⅰ组 Rhodopsin （37.97±7.84）%、NSE（21.59±2.98）%、GFAP（20.73±5.25）%，条件培养液 Ⅱ组 Rhodopsin（10.23±2.05）%、NSE（16.24±1.10）%、GFAP（15.92±0.96） %，条件培养液Ⅲ组 Rhodopsin（0）、NSE（6.24±4.58）%、GFAP（4.96±1.79）%。 将三种培养条件下所表达的阳性细胞分别进行统计学分析，组间差异有统计学意 义。 RT-PCR 鉴定也显示同样结果：条件培养液Ⅰ组 Rhodopsin （ 0.3915 ± 0.00644）、NSE（0.2019±0.00682）、GFAP（0.1972±0.00211），条件培养液Ⅱ组 Rhodopsin（0.0983±0.00319）、NSE（0.1048±0.00323）、GFAP（0.1040±0.00254）， 条件培养液Ⅲ组 Rhodopsin（0.0044±0.00126）、NSE（0.0498±0.00149）、GFAP （0.0467±0.00333）。 结论：光损伤 SD 大鼠视网膜片培养上清液可诱导 SD 大鼠骨髓间充质干细 胞分化为视网膜样细胞，研究结果为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。 关键词：骨髓间充质干细胞 视网膜样细胞 光损伤 分化 In vitro differentiation of rat mesenchymal stem cells into retina-like cells by the supernatant fluid of light-injured neurosensory retina Post gra dua te: Bai yue Tutor : Xu Guo-xing Prof. 【Abstract】 Objective: To explore the possibility of inducing SD rat mesenchymal stem cells (MSCs) into retina-like ce