贵州小型猪胆汁淤积性肝纤维化模型的建立外科学专业论文.docxVIP

5 5 前 言 胆道梗阻是肝胆外科常见疾病之一。严重的胆道梗阻病变，如儿童先 天性胆道闭锁，常在短时间内发展为胆汁淤积性肝纤维化，最终可能导致 患者肝功能衰竭，甚至死亡。建立一种理想的胆道梗阻动物模型，能够为 该类疾病的研究奠定良好的基础。 近年来，国内外研究淤胆型肝纤维化多采用小动物 SD 大鼠建立动物 模型，而大动物模型相对较少。本研究选用贵州小型猪作为实验动物，尝 试建立一种更加接近于人类的大动物胆汁淤积性肝纤维化模型，为该类疾 病的研究提供一个可靠的实验平台。同时，初步探讨 Fas 蛋白的表达、肝 细胞凋亡在肝纤维化发生发展中的可能作用。 PAGE PAGE 6 材料与方法 1 实验材料与仪器 1.1 实验动物 选取雌性贵州小型猪 8 头，4-5 月龄，体重(12-15)kg，由成都达硕生 物有限公司提供，许可证号 scxv(川)2008-24。在三级大动物实验室分笼饲 养，喂以普通混合猪饲料，自由饮水。 1.2 手术器械 腹部手术器械包，由泸州医学院外总实验室提供。 1.3 主要药物 戊巴比妥钠 德国默克公司生产 硫酸阿托品注射液 西南药业股份有限公司生产 2 主要试剂及试剂盒 凝血功能全套试剂盒 德国 Siemens 公司生产 生化全套试剂盒 德国 Siemens 公司生产 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒 德国 Roche 公司生产 Anti-Fas 载脂蛋白 1 抗体 北京博奥森生物技术有限公司提供 3 主要实验仪器 多项目自动血球分析装置 日本SYSMEX公司制造 CA-7000凝血功能分析装置 日本SYSMEX公司制造 JEM-1400透射电镜 日本电子株式会社制造 ADVIA 2400全自动生化分析仪 德国西门子公司制造 i6000-全自动免疫组化染色仪 美国Biogenex公司制造 DHG-9240型电热恒温鼓风风干箱 上海申贤恒温设备厂制造 OLYMPUS BX53光学显微镜 日本Olympus公司制造 图像采集仪 日本 Olympus 公司制造 4 实验方法 4.1 建立模型 实验猪术前禁食 12h，禁饮 6h。术前30min 给予 阿托品 0.5mg 肌肉注 射，3%戊巴比妥1ml/kg 腹腔内注射麻醉，麻醉显效后，穿刺耳缘静脉采 血并建立静脉通道。无菌条件下剖腹显露肝脏、肝门及肝十二指肠韧带， 楔形切取小块肝组织（约 1cm3 大小）留作术前光镜及电镜标本，缝合肝脏 创面。在肝十二指肠韧带中暴露胆总管，以 5ml 注射器回抽出金黄色胆汁 证实后游离之，双线结扎胆总管，并于两线间离断胆总管。严格止血，检 查术野无活动性出血后，逐层关腹。麻醉清醒后送回动物房，继续原条件 喂养。 4.2 采血和标本取样 在胆总管结扎术前 30min，经耳缘静脉抽血分别作血常规、凝血功能 及肝功能检查作为正常对照。在术后 7d、术后 14d、术后 28d 以相同方法 抽血作血常规、凝血功能及肝功能检测。 实验猪分别于术后 7d、术后 14d、术后 28d 在麻醉下行肝组织活检。 经右肋缘下小切口入腹，切取小块肝组 织 标 本（1 cm3），分别作光镜和电 镜检查。光镜切片在 10%中性甲醛固定后制备石蜡块，制成 4μm 切片，分 别行 HE 染色、胶原纤维染色（Masson 染色），TUNEL 原位法检测细胞凋 亡，免疫组化检测 Fas 蛋白表达情况。电镜切片另行制备。 PAGE PAGE 8 4.2.1 血液指标检测 采用多项目自动血球分析装置分析血常规；CA-7000 凝血功能分析装 置按照试剂盒说明检测凝血酶原时间、凝血酶时间及纤维蛋白原；利用 ADVIA 2400 全自动生化分析仪按照试剂盒说明书测定血清谷草转氨酶、 总蛋白、白蛋白、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶。 形态学观察 取各实验时间点（术前、术后 7 d、术后 14 d、术后 28 d）猪肝组织石 蜡切片，行 Masson 染色和 HE 染色，用 OLYMPUS BX53 光学显微镜观察。 HE 染色 1) 石蜡切片脱蜡至水； 2） 苏木素染液染色 5 min，蒸馏水洗 4 次； 3） 1％盐酸乙醇分化 20 s，1：400 氨水返蓝，间以蒸馏水洗 l min； 4） 0.5%伊红酒精溶液染色 5 min，蒸馏水洗 30 s； 5） 脱水；透明；干燥；封片。 Masson 染色： 1） 石蜡切片脱蜡至水； 2） 三氯化铁与苏木素等量混合制备的试剂染色10min； 3） 1%盐酸乙醇分化液分化，水洗，氨水返蓝，水洗； 4） 蒸馏水水洗 1min； 5) 丽春红酸性品红染色液染色 6min； 6) 0.2%乙酸水溶液洗 1min； 7) 1%磷钼酸水溶液洗 2min； 8) 0.2%乙酸水溶液洗 1min； 9) 苯胺蓝染色液染色 2m