海岛棉GbPDF2基因的克隆及功能分析-林木遗传育种专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文，是受科技专项“棉花纤维突变体候选基因的 克隆与功能验证”（项目号：2045210042）、国家自然科学基金 (项目号、浙江省自然科学基金 (项目号：LQ12C06002)和抗草甘膦转基因棉花 研发(浙江省新安化工集团股份有限公司，2013-2014)，在指导教师指导下，通过 我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢 中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不 包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同 对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有 严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送 交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。□ 不保密, 本学位论文属于不保密。 □ (请在方框内打“√”) 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 指导教师亲笔签名： 日 期： 摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘要 棉花是我国重要的经济作物之一，棉纤维是纺织工业的重要原料。棉纤维是由种 子表皮细胞生长而来，了解其发育分子机理有助于在分子水平上调控纤维的产量与品 质。PDF2 基因是 HD-ZIP IV 家族中一个重要的转录调节因子，而该家族基因成员在 拟南芥中主要参与根毛的发育和表皮细胞的分化，同时调节花色素苷的积累和毛状体 形成等。因此本研究采用同源克隆的方法，以亚洲棉品种亚洲棉 3 号(HD1 基因突变 体)和 4 号(HD1 基因正常)、海岛棉和陆地棉品种 TM-1 为实验材料，分析 PDF2 基因 在棉纤维起始分化发育分子调控网络中的作用。 1、采用同源克隆的方法从海岛棉中分别克隆到 PDF2 基因的 A 亚组和 D 亚组全 长 DNA 序列，BLAST 比对发现 PDF2 基因含有 10 个外显子和 9 个内含子；用 DNAMAN7 分析发现 A 亚组全长基因可翻译出 744 个氨基酸；D 亚组全长基因可翻 译为 734 个氨基酸；海岛棉的 A 亚组和 D 亚组的碱基序列存在很大的差异，即与 D 亚组相比，从 ATG 开始，A 亚组在 80bp 处有 6 个碱基的缺失，在 693bp 处有 36 个 碱基的插入。PDF2 基因含有 HD-ZIP IV 家族中最典型的 2 个保守结构域，即 Homeobox domain 和 START domain。进化分析表明 GbPDF2 基因的起源时间与拟南 芥、葡萄的起源时间最为接近，即与拟南芥、葡萄的进化时间相近，亲缘关系最近。 在棉花中 ATML1 的同源基因 GhHD1 和 GbPDF2 基因的进化起源时间则相差较远， 这两个基因的碱基序列间的变异较大，功能变异可能较大。进化树又可分为两个小的 分支，即单子叶植物水稻、高粱、二穗短柄草和玉米聚为一类，其他的双子叶植物聚 为一类。 2、利用 RT-PCR 和 Real-time PCR 技术初步研究了该基因在棉纤维不同发育阶段 的表达特性。比较亚洲棉 3 号(HD1 基因突变体)和 4 号(HD1 基因正常)的表达量后发 现 PDF2 基因在 0 DPA 胚珠和 5 DPA 胚珠中的表达量差异较大。和在亚洲棉中发现 的一样，在陆地棉(TM-1)和海岛棉中，PDF2 基因在 0 DPA 时期的表达量达到峰值， 此后表达量随之下降，在 5 DPA 时期又略有上升，随即下降。因此可初步说明 PDF2 基因参与调控棉纤维的起始分化发育。 3、利用 Gateway 法构建 GbPDF2-RNAi 的干扰表达载体，转入农杆菌 GV3101， 利用花絮浸染法侵染拟南芥，得到 T2 代转基因拟南芥。通过电镜和表型观测，RNAi 干扰的阳性转基因拟南芥植株的表型变化不太明显。 I 4、利用同源克隆的方法克隆到 GbPDF2 基因的启动子，并在 PLACE 网站在线 分析 GbPDF2 启动子序列，结果表明序列中含有多种典型的高等植物启动子顺式作 用元件 CAAT-BOX、GATA-BOX、TATA-BOX。此外该启动子还带有参与生长素、 ABA 和乙烯反应，热激蛋白的结合位点，参与 L1 layer-specific 和根毛发育，WRKY 蛋白的结合位点，MYB 结合位点等。为进一步研究棉花 GbPDF2 基因的组织特异性 表达特征，构建了 pCXGUS-GbPDF2 表达载体，转染拟南