汉城病毒M片段和汉滩病毒部分S片段核酸疫苗pEGFP-M-S的构建及基因免疫研究-病原生物学专业论文.docxVIP

送垫壅耋坚盐嬖塑婆整丛墨墅坌!垃垦璧墼壅堇E墨鱼里￡：M：§笪塑蕉星董旦鱼壅必——里塞塑量一中文摘要 送垫壅耋坚盐嬖塑婆整丛墨墅坌!垃垦璧墼壅堇E墨鱼里￡：M：§笪塑蕉星董旦鱼壅必——里塞塑量一 中文摘要 目的：我国流行的肾综合征出血热主要由汉坦病毒属的汉城型病毒和汉滩型病毒 引起，多属汉滩型为主或汉城型为主的混合型疫区，仅接种单一型别的汉坦病毒疫苗， 不能完全预防其他型病毒的交叉感染。因此，迫切需要研制和开发双价或多价汉坦病 毒疫苗。l、本课题的第一部分利用含有卡那霉素抗性基因的真核质粒表达载体 pEGFP，通过构建同时含有汉城型病毒Z37株完整的M片段和汉潍型病毒国际标准株 76．118株s基因中编码核蛋白主要抗原表位约0．7kb片段的重组核酸疫苗pEGFP-M—S， 希望能够同时充分发挥有保护性抗原作用的M片段编码的糖蛋白、s基因编码的核蛋 白的保护性免疫作用，为利用含有两型汉坦病毒抗原性片段的重组DNA疫苗进行基因 免疫的研究奠定物质基础，以期在疫区能够同时控制两型汉坦病毒的感染，为研制汉 坦病毒的DNA疫苗奠定基础。 2、本课题的第二部分首先用不同剂量的重组质粒pEGFP—M．S以肌肉注射的方式 对BALB／c4．鼠进行基因免疫，检测免疫小鼠的特异性的体液免疫和细胞免疫应答状 况。然后对鼻腔漓入免疫方式和肌肉注射免疫方式对免疫小鼠产生的特异性的体液 免疫和细胞免疫应答的状况进行比较研究。 方法：l、以质粒pUCM(含有汉城型病毒Z37株M片段l一1678bp)为模板，PCR 扩增47—1666bp的产物，装入质粒pcDNA3．1，记为重组质粒M1；以质粒pGEM(含 有汉城型病毒Z37株M片段1601．3638bp)为模板，PCR扩增1661．3445bp的产物，装 入质粒peDNA3．1，记为重组质粒M2；将质粒Ml和M2分别用BamH I和Kpn I双酶 切，分别回收7．Ikb的大片段和I．8kb的小片段，连接起来，记为重组质粒pcDNA3．1．M。 以质粒PJSAl 175-HVS(含有汉滩病毒76．118株s基因)为模板，PCR扩增40．795bp 的产物，装入质粒pEGFP，记为重组质粒pEGFP．HTNV-S0．7。用Xho I和Pst I双酶 切pcDNA3．1-M，回收3．4kb的小片段，与经同样双酶切并回收5．4kb大片段的 pEGFV·HTNV-S0．7用酶切位点连接，构成4．1kb的重组基因，记为pEGFP-M-S，并转 车课题承担国家自然科学基金题与扛苏省病原生物学重点实验室课题资助 堡挞壅查丛堕嬖塑堡韭堕童塑坌!丛嬖堕墼壅苴P星鱼呈￡：M：璺丝塑蕉垦基固鱼壅墅塞生塞塑墨一 堡挞壅查丛堕嬖塑堡韭堕童塑坌!丛嬖堕墼壅苴P星鱼呈￡：M：璺丝塑蕉垦基固鱼壅墅塞生塞塑墨一 染进成纤维细胞，进行48、72h表达。 2、大量抽提重组质粒，三种不同剂量(11．tg、101,tg、50txg)重组质粒免疫组分别 经股四头肌注射BALB／cdx鼠，采用酶联免疫吸附实验检测特异性抗体IgG、IgA。无 菌取小鼠脾细胞，检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性；以流式细胞仪进行T淋巴 细胞亚群检测CD4+、CD8+T细胞百分率；MTT法检测淋巴细胞的增殖能力。 3、以50昭重组质粒pEGFP-M-S进行股四头肌肌肉注射或鼻腔滴入两种方式免疫 小鼠。采用酶联免疫吸附实验检测特异性抗体IgG、IgA。无菌取小鼠脾细胞，检测 细胞毒性T淋巴细胞(cTL)活性；以流式细胞仪进行T淋巴细胞亚群检澳t．ICD4+、CD8+ T细胞百分率；MTT法检测淋巴细胞的增殖能力。 结果：l、成功地得到重组质粒M1、M2、pcDNA3．1．M、pEGFP．HTNV．SO．7及 pEGFP-M-S。 2、三种不同剂量(1rtg、101xg、501．19)重组质粒免疫组分别经股四头肌注射BALB／c 小鼠·11．tg核酸疫苗免疫组和空载体对照组始终为阴性反应；lO恤g和50恤g组在不同的 血清稀释度均itgGl年l性反应，OD值随免疫剂量的增加而增加，血清特异性抗体滴度 均为1：160。随着免疫次数的增加，101．tg和501ag免疫组小肠液中的特异性IgA抗体的量 与对照组有显著性差异(Po．05)。在最后一次免疫结束后2wk，随着E：T比值的增大， 10lag和501ag免疫组对靶细胞的特异性的杀伤作用也不断增大，与对照组有显著性差异 (P0．05)，而11．tg免疫组和空白载体对照组几乎无杀伤活性。随着免疫剂量的增加和 免疫次数的增多，各组免疫小鼠脾细胞中CD4*、CD8+T细胞的量呈现为有规律的递 增。各疫苗免疫组小鼠的脾细胞经ConA刺激后，均表现为明显的淋巴细胞增殖效应， 刺激指数与空载体对照组有显著性差异(Po．05)。 3、以肌