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线粒体DNA在百草枯中毒机制中作用 【摘要】目的利用体外实验研究线粒体DNA（mtDNA） 在百草枯（PQ）致病机理中的作用。方法首先用PQ处理人 II型肺泡上皮细胞（A549细胞），应用CCK-8法检测细胞生 存率，然后利用绝对定量PCR的方法检测培养上清液中mtDNA 的含量，以激光共聚焦成像法检测线粒体膜电位来验证PQ 对线粒体的损伤作用。接着通过Transwell趋化实验检测 mtDNA对人外周血单个核细胞（PBMC）及中性粒细胞（PMN） 的趋化活性，并用流式细胞术确定趋化细胞的亚型。同时应 用Xcelligence系统和体外血管通透性试剂盒检测了 mtDNA 对血管通透性的影响。最后验证mtDNA在细胞增殖方面的作 用。结果PQ致A549细胞损伤的半数致死浓度为600 umol/L, 且A549细胞的生存率及对线粒体的损伤存在浓度和时间依 赖关系（P 【Key words] Paraquat； Mitochondrial DNA ； Inflammation response ； Cell proliferation； Peripheral blood mononuclear cells ； Neutrophils ； Mitochondrial membrance potential ； Vascular permeability； Transforming Growth Factor-Beta 1 百草枯（paraquat, PQ）是一种广泛使用的有机杂环类 接触性脱叶剂及除草剂。它可以导致哺乳动物严重的肺损 伤，主要表现为间质水肿，白细胞浸润，肺泡出血，纤维细 胞增殖和胶原沉积的增多[1],这些损伤可以导致哺乳动物 的死亡。在人类也有相似的一个炎症过程发生，从破坏性阶 段存活下来的患者将会发展至第二个增殖阶段，最终患者以 呼吸衰竭死亡，病死率极高（75%?100%） [2]。截至今日， 虽然PQ中毒的毒理机制仍不明了，但所有学者已达成共识 的是PQ中毒的早期阶段就是一个炎症反应过程。最近线粒 体DNA （mtDNA）在各种炎症反应中的作用引起了很多学者的 关注，并已经有很多研究显示了 mtDNA在炎症反应中的关键 作用，但mtDNA在PQ中毒所致炎症反应的作用还没有人做 过研究，因此本文拟探讨mtDNA在PQ所致肺损伤及纤维化 中的作用。 1材料与方法 1. 1细胞及试剂 A549细胞株、HFL1细胞株（中科院上海细胞库），HUVEC 细胞株（上海仁济医院消化所馈赠）。百草枯（美国Sigma 公司）。RPMI 1640、谷氨酰胺、0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清 （美国Gibco公司）,100 U链霉素-青霉素、磷酸盐缓冲液 （中国 Hyclone 公司）。SYBR Premix Ex TaqTM Pefect Real time 试剂盒（日本 TaKaRa 公司）。cell counting kit-8 （日 本 Dojindo 公司）。Anti-Human CD 14 APC、Anti-Human CD 19 PE、Anti-Human CD3 FITC （美国 eBioscience 公司）。In Vitro Vascular Permeability Assay （美国 Millipore 公 司）。 1.2主要仪器 SterilGard Ill advance 洁净工作台（美国 Baker 公司）， 5%C02电热恒温培养箱（美国NAPCO 5410）,倒置显微镜（日 本 NIKON）, GeneAmp PCR System 9700、AB I Prism 7900 Sequencer Detector （美国 Applied Biosystems 公司）， 酶标比色仪（美国Model 550, Bio-RAD）,流式细胞仪（美 国，BD FACSCalibur） Xcelligence RTCA （瑞士 Roche 公司）。 1. 3方法 1.3. 1细胞培养人II型肺泡上皮细胞A549细胞，人肺成 纤维细胞HFL1细胞，人脐静脉血管内皮细胞HUVEC细胞在 含10%胎牛血清+1.0 mmol青链霉素+1.0 mmol谷氨酰胺的 RPMI-1640培养基中传代培养，培养细胞置于37 °C, 5%C02 培养箱中，待细胞长满单层后，用0. 25%胰酶-EDTA消化，1 : 2 或1： 3传代培养，选取对数生长期细胞进行实验处理。 1. 3. 2百草枯处理后A549细胞生存率及mtDNA的含量测 定A549细胞以20 000个细胞/孔种在96孔板，设正常组及 100、300、600、800、1000 umol/L5 个浓度组及 0、1、2、 4、8、12、24、48、72 h几个时间段，测定出终实