维生素D受体基因多态性和慢性乙型肝炎患者关联探究.docx

维生素D受体基因多态性和慢性乙型肝炎患者关联探究 【摘要】目的：探讨维生素D受体（VDR） Fok I基 因多态性与慢性乙型肝炎患者临床表型的关联。方法：应用 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）技 术检测VDR Fok I基因的多态性在44例慢性乙型肝炎重度患 者、46例中度患者和40例非活动性HBsAg携带者中的分布, 并进行基因型分析。结果：慢性乙型肝炎重度组、慢性乙型 肝炎中度组VDR FokI基因的基因型与对照组（非活动性 HBsAg携带者）比较差异有统计学意义（P0. 05）,具有可比 性。 1. 2方法 1.2. 1实验室检查肝功能相关指标，包括AST/ALT.血 清总胆红素TBIL.凝血酶原活动度PTA、血清白蛋白；检测 HBsAg、anti-HBs. HBeAg、anti-HBe 和 anti-HBc 及 HBV-DNA 滴度。 1.2.2基因组DNA的提取 留取慢性乙型肝炎中度及重 度患者和非活动性HBsAg携带者空腹12 h后，晨起静脉采 血4 mL （EDTA抗凝），采用硅胶柱纯化方式，用血液DNA提 取试剂盒（D3741-01美国OMEGA）,从700 ?L抗凝血液中提 取淋巴细胞基因组DNAo利用UV计测定所提取的DNA浓度及 纯度，并将其稀释至10 ng/?L,分装保存于-20 °C冰箱保存 备用。 1.2.3聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP) VDR Fok I基因的引物序列：上游引物，5, -AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3 ； 下游引物，5 , -ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3o总反应体系均为 25 uL： 1 ?L基因组DNA, 2.5 ?L 10XPCR缓冲液，上下游引物各 0.5 uL, dNTPs 2 ?L, 0. 25 ?L Taq DNA 聚合酶，去离子 水 18. 25 ?Lo VDR Fok I PCR 扩增条件：95 °C预变性 4 min； 98 工变性 10 s, 63退火 30 s, 72 °C延伸 60 s,共 30 个循环；72 °C再延伸5 mino取扩增的PCR产物0. 5 ?L, 1 ?L 限制性内切酶 Fok I ,及 2?L 10XM Buffer, 2 ?L 0. 1% BSA (由大连TaKaRa公司提供)及14.5 ?L灭菌水组成酶切总 反应体系20 ?L,置于37 °C水浴1 h,进行Fok I酶切，将 酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以DL700 Marker为参考， 紫外凝胶成像仪下观察结果。 1.3观察指标比较慢性乙型肝炎现症患者重度组、中 度组和对照组VDR基因多态性的差异；VDR Fok I基因多态 性与慢性乙型肝炎不同病情程度的关联程度。 1.4统计学处理 分别统计CHB现症患者重度组、CHB现 症患者中度组和对照组非活动性HBsAg携带者基因型和等位 基因的分布频率数据，用SPSS 13.0统计软件分析， Hardy-Weinberg遗传平衡检验，P>0. 05认为资料可靠，代 表性好。计数资料采用字2检验，以P 3讨论 VDR基因定位于12号染色体长臂，其包含有11个外显 子，在基因组上总长为75 Kb, VDR包含427个氨基酸残基, 分子量为50 KD[4]o目前报导的VDR基因多态性与4个单核 昔酸多态性位点有关，分别为2号外显子的FokI位点、第 8内含子的Bsm I位点、Apa I位点及第9外显子的Tap I位 点。近年来，人们逐渐认识到VDR的基因多态性除了参与调 节钙磷代谢外，其有着更广泛的生理作用，女口：抗增殖、抗 分化、调节细胞凋亡、介导免疫反应及多种内分泌腺激素的 分泌，调节造血组织造血等作用[5-6] o 研究证明，Treg细胞和Thl7细胞这两种细胞亚型参与 了免疫介导性肝炎的发病机制。Treg细胞为体内致免疫耐受 的主要细胞，其有效控制病原体的T细胞反应，而Thl7细 胞主要通过产生细胞因子，如IL-17可促进炎症反应，这两 种细胞亚型在特定的某些细胞因子等因素的作用下，可相互 转换，相互制约[7-9] o Sneha等[10]研究发现1, 25- (0H) 2D3可以通过阻碍IL-17转录因子活化T细胞核因子(NF-AT) 复合体的形成，从而抑制IL-17的分泌，进而减轻Thl7细 胞介导的促炎症反应。另有研究表明，1, 25- (OH) 2D3及 其类似物通过作用于树突状细胞的nVDR,抑制了树突状细胞 的成熟，使其处于未成熟状态，因此其不能激活初始T细胞, 进而使免疫反应不能继续[11-12] o目前认为，不成熟树突 状细胞可分泌TGF-b和/或IL-10来诱导初始T细胞向Treg 细胞转化，增加