新药研发中药理毒理研究内容与要求学科介绍课程讲述.ppt

哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 药物作用时间: 药物和细胞接触非活化组作用24h和48h收获细胞, 代谢活化组作用6小时以上 标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在24h和48h收获细胞 对照：空白、溶剂、阳性和Ｓ９对照 镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相，在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相关; CHL系统判定如下: 畸变率 5% 阴性 (-) 畸变率 5% 可疑 (±) 畸变率 10% 阳性 (+) 畸变率 20% 阳性 (++) 畸变率 50% 阳性 (+++) 注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验 啮齿动物微核试验 动物：首选ＮＩＨ小鼠，每组１０只性成熟小鼠，雌雄各半，或至少６只性成熟雄性小鼠 给药途径与方法：尽可能和临床拟用途径相同，一般为单次给药或诱导给药，必要时可多次给药 骨髓采样时间：通过预试，在12-72h不同时间内，取5个作用点，找出合适采样时间，如无差别一般采用24h采样 剂量：≥3个，最高剂量1/2 LD50 对照组：用溶媒作阴性对照，用已知能诱发微核增加的物质作阳性对照 啮齿动物微核试验 标本制作：取骨髓、涂片、Giemsa或丫啶橙荧光染色 镜检：每只动物至少计数1000个多染红细胞，Giemsa染色，观察其微核出现的频度及多染红细胞和正常红细胞的比率。丫啶橙荧光染色，则直接观察微核出现的频度 判定： 1.受试物所诱发的微核率的增加与剂量相关 2.某一测试点微核增加可重复并有统计学意义 符合上述一条即可判为阳性 啮齿动物微核试验 注意： 1.对Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果的药物，必须用荧光染色以进一步肯定或否定阳性结果 2.不易通过骨髓屏障的药物，可补充用哺乳动物胎肝细胞微核试验进一步研究 3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择UDS试验或SOS显色试验 生殖毒性(致畸)试验 一般生殖毒性试验 致畸敏感期毒性试验 围产期毒性试验 生殖毒性试验-致畸敏感期毒性试验 动物：首选Wistar 或SD大鼠，也可用小鼠或家兔Ｉ类最好增加家兔或猪、猴、狗之一 动物数：每组孕大、小鼠≥１５只，孕兔≥ ８只 剂量：高、中、低三个剂量，限度剂量为1g/kg。高剂量产生母体毒性，或为最大给药量。摄食量减少，体重增加缓慢或下降, 阴道流血、流产等均是毒性反应表现。低剂量无母体和胚胎毒性 给药途径：同推荐临床给药途径，但不宜采用腹腔注射，口服制剂除灌胃外，还可在严格测定其消耗量的前提下自由摄取或拌入饲料 生殖毒性试验-致畸敏感期毒性试验 给药时期：于胚胎器官形成期连续给药，大鼠孕后6-15天，小鼠6-15天，家兔6-18天 对照：必须设溶剂对照。必要时设阳性对照 观察和检查：查到精子或阴栓作为妊娠零天，记录实验动物症状，大鼠于0、3、7、10、13、16、20天称量体重，２０天处死，记录孕鼠重、黄体数、死胎数（着床数、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎数、活胎重、性别、外观异常等。约1/2胎仔固定于Bouin氏液，作内脏检查，另1/2固定于95%洒精作骨骼畸形检查 生殖毒性试验--致畸敏感期毒性试验 报告：将数据列成表，提供药物对孕期和胚胎的影响，包括孕鼠数及体重变化，黄体总数及均数，活胎总数及均数，活胎重，性别，死胎总数及着床数，吸收胎，早期和晚期死胎等；药物对胎仔各器官的影响，包括在外观和内部检查中发现的各种畸形；药物对胎仔骨骼发育的影响，包括头颅骨、胸骨、前、后肢骨和其它骨骼的骨化程度，变异和畸形等 判定：各项数据经统计处理后判定药物的胚胎毒性和致畸潜力 致癌试验 短期致癌试验 哺乳动物培养细胞恶性转化试验 小鼠肺肿瘤诱发短期试验 长期致癌试验 致癌试验哺乳动物培养细胞恶性转化试验(短期) 剂量：≥3组，高剂量一般以抑制50%集落生长浓度为基准 药物接触时间：药品一般和细胞接触24h，然后再培养7-14天 代谢活化：应说明外源性代谢活化系统 对照：空白、溶媒、阴性和阳性对照 观察报告：将细胞固定、染色、分别计算每皿集落数，转化集落数，转化频度＝转化集落数/106存活细胞，转化率＝转化集落数/总集落数 致癌试验哺乳动物培养细胞恶性转化试验(短期) 判定：1.有明确量效关系；2.若无量效关系，但在≥２个浓度中发生细胞转化；3.在单一剂量下出现≥３个转化集落时 符合上述一条件者可判为阳性，否则为阴性。如判定有困难时，应进一步对细胞进行核型分析，软琼脂接种等观察判定，必要时可做动物接种生瘤试验 长期致癌试验 动物：幼年小、大鼠，♀♂各半。每组１００只 剂量：≥３个，低剂量１-３ACD，其余剂量可