海蜇Wnt信号途径关键节点基因的克隆与表达-海洋生物学专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 II II 3.06 和 2.76 倍。 2. 首次解析了海蜇 Wnt5 基因的 cDNA 和基因组结构：Re-Wnt5 基因的 cDNA 全长 1647 bp，其中编码区长 1059 bp，编码了 353 个氨 基酸的多肽。SMART 分析表明，Re-Wnt5 具有 Wnt 家族共同的结构 特征，包括一个由 20 个氨基酸组成的信号肽，2 个 N-糖基化位点和 24 个保守的参与二硫键形成的半胱氨酸。Blast 分析表明，Re-Wnt5 基因与来自刺胞动物、无脊椎动物和脊索动物的 Wnt5、脊椎动物的 Wnt5a 和 Wnt5b 具有高度相似性。基于邻接法构建 Wnt5 的系统进化 树揭示，来自刺胞动物门不同物种的 Wnt5 首先聚类为一支，在脊索 动物文昌鱼 Wnt5 之后，Wnt5a 和 Wnt5b 产生分歧，形成了两个进化 分支。Wnt5 基因的起源可能是伴随多细胞动物祖先形成过程产生的， Wnt5a 和 Wnt5b 两个进化分支发生在脊索动物文昌鱼之后。Re-Wnt5 基因组含有 4 个外显子和 3 个内含子，结构与刺胞动物的 Wnt5、脊椎 动物 Wnt5a 和 Wnt5b 的基因组相似；但总长度仅类似于刺胞动物的 Wnt5，明显小于脊椎动物 Wnt5a 和 Wnt5b。实时荧光定量 PCR 显示， Re-Wnt5 基因在海蜇的螅状体、横裂体、碟状体和稚水母四个发育阶 段均有表达，但存在着明显的发育表达差异，其中横裂体阶段的表达 量最高，分别是螅状体、碟状体和稚水母表达量的 12.38、9.99 和 13.01 倍，而表达量最低的发育阶段是碟状体阶段。 3. 首次解析了海蜇 Frizzled1 基因的 cDNA 和基因组结构：ReFzd-1 基因的全长 cDNA 为 2387 bp，其中编码区为 1761bp，编码 586 个氨 III III 基酸的多肽。SMART 分析表明，ReFzd-1 基因具备 Frizzled 家族共同 的结构特征，包括：一个由 23 个氨基酸组成的信号肽，一个含有 10 个保守的半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域（CRD）以及由七个跨膜蛋 白组成的跨膜区。Blast 分析表明，ReFzd-1 基因与来自刺胞动物的贝 螅 H. echinata 、水螅 H. vulgaris 、半球美螅水母 C. hemisphaerica 和 海葵 N. vectensis 具有高度相似性，与人 H. sapiens, 鼠 M. musculus, 爪 蟾 X. laevis 和斑马鱼 D. rerio 的 Frizzled1、Frizzled2 和 Frizzled7 具有 较高的同源性。利用 N-J 法将人、鼠爪蟾、斑马鱼和果蝇所有 Frizzled 家族基因构建系统树显示，所有 Frizzled 家族成员聚类成 11 个亚家族， 进一步可划分成 4 个类群，海蜇 ReFzd-1 基因与刺胞动物门的 Frizzled 聚类在一起，然后与 Frizzled1、Frizzled2 和 Frizzled7 三个亚家族聚成 一个类群。采用荧光定量 RT-PCR 结果显示，ReFzd-1 基因在海蜇无性 繁殖的四个发育阶段螅状体、横裂体、碟状体和稚水母均有表达，其 中横裂体阶段表达量最高，水母体阶段表达量最低。ReFzd-1 基因在 海蜇内胚层的表达高于其在外胚层的表达量，前者是后者的 5 倍。整 体原位杂交结果显示，在海蜇横裂体阶段，ReFzd-1 主要表达在横裂 体的基盘和触手，发生横裂的部位也高度表达。 上述研究结果表明，海蜇 Wnt 信号调控途径的三个关键节点基因 Wnt4、Wnt5 和 Frizzled1 参与了海蜇的无性繁殖的各个过程，并在横 裂生殖过程中发挥了重要的调控作用。 PAGE PAGE VI 关键字：海蜇，Wnt4，Wnt5，Frizzled，cDNA，基因组结构，实时荧 光定量 PCR，整体原位杂交技术 Cloning and expression of the key gene in Wnt signaling pathway from Rhopilema esculentum Abstract In this study, by 454 GS-FLX sequencing technique and RACE technique, the cDNA and genomic organization of the key gene in Wnt signaling pathway from R. esculentum was selected and cloned. Real-time PCR and Whole mount in