基于竞争触发滚环扩增的荧光适配体传感器高灵敏检测凝血酶-分析化学.PDF

第43卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 特约来稿 第11期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2015年11月 ChineseJournal of Analytical Chemistry 1688~1694 DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.150527 基于竞争触发滚环扩增的荧光适配体传感器高灵敏检测凝血酶 *1 1 1 1 1 2 2 张松柏 摇 郑丽英摇 胡 霞摇 沈广宇摇 刘学文摇 沈国励摇 俞汝勤 1 2 (湖南文理学院化学化工学院,常德415000)摇 摇 (湖南大学化学化工学院,长沙410082) 摘摇 要摇 利用目标蛋白、适体探针、挂锁探针和与适体探针匹配的互补序列之间的竞争反应,发展了一种基于 滚环扩增的高灵敏荧光适配体传感器。 在不含目标蛋白时,互补序列由于与适体探针杂交形成双链,因此不 能与挂锁探针杂交以触发连接鄄滚环放大反应。 相反,有目标蛋白存在时,由于目标蛋白与适体探针结合,使 得互补序列被置换下来,从而可以与挂锁探针杂交。 在DNA连接酶的作用下,挂锁探针被进一步环化并在 Phi29 DNA聚合酶的作用下发生滚环扩增反应。 扩增产物含有许多能与分子信标检测探针环状部分杂交的 重复序列,从而分子信标被打开产生荧光信号。 对互补序列的长度及挂锁探针的浓度进行了考察。 在优化的 实验条件下,本传感系统可以实现对的凝血酶高灵敏检测,线性范围为0.067 ~32 nmol/ L,检出限为 0.03 nmol/ L(约90 amol 目标分子)。 通过设计不同的适体探针和相关核酸序列,本传感系统可以作为一种通 用型方法用于其它目标物的分析。 关键词摇 核酸适配体;滚环扩增;分子信标;荧光;凝血酶 1摇 引摇 言 临床上对恶性肿瘤进行快速灵敏筛查常以肿瘤标志物作为检测的目标分子。 肿瘤标志物是一类由 肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤形成、发生相关的物质,主要是肿瘤抗原、激素、酶及其同工酶等。 例如凝 血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶,具有催化纤维蛋白元变成纤维蛋白,促进血液凝 固和调控凝血等作用,在解释肿瘤的发生机制及作为早期诊断、疗效及预后判断等方面均具有重要意 [1,2] 义 。 发展可以高灵敏检测这些肿瘤标志物蛋白质的生物传感器是恶性肿瘤早期诊断的一个非常有 效的方法。 近年来,核酸适配体技术的发展为肿瘤标志物蛋白质的检测提供了新的契机。 核酸适配体是通过 [3,4] 配体指数富集系统进化技术在体外筛选得到的单链DNA或RNA寡核苷酸片段 ,可高特异性结合蛋 白质、小分子,甚至细胞。 核酸适配体作为一种新型分子识别元件,具有独特的优势,如适体合成简单、 特异性强、稳定性好、容易标记和修饰等,被广泛应用于蛋白质分析、药物筛选、疾病诊断、生物传感器 [5] 和分子识别元件的设计等方面。 已报道的利用核酸适配体检测蛋白质的技术和方法包括比色法 、荧 [6] [7] 光法 、电化学法 等。 相比于电化学方法需要多步的界面反应及繁琐的操作,荧光法具有操作方便、 响应快速、重现性好等优点,但其检测灵敏度低于电化学方法。 因此,荧光适配体传感器中常需要进行 信号放大。 [8] 滚环扩增作为一种恒温下进行的扩增反应,