生物化学与分子生物学试验指导-天津中医药大学.PDF

生物化学与分子生物学实验指导 天津中医药大学 中药学院 生药教研室 实验一 维生素 C 的含量测定 一、实验目的 1.掌握碘量法测定维生素 C 的原理和方法； 2. 了解维生素 C 常用的含量测定方法。 二、实验原理 维生素 C 又称抗坏血酸、系人体一种重要营养素。为水溶性，主要存在于 新鲜蔬菜、水果中(其中西红柿、鲜枣、山楂、辣椒、桔子中含量最多)。其主要 生理功能是：促进体内胶元蛋白及粘多糖合成;增加毛细血管壁致密性，减低其 脆性与通透性;参加体内氧化还原反应;有解毒作用。如缺乏维生素 C 可发生坏血 病。临床用于各种维生素 C 缺乏症、肝脏疾病、中毒等。 本试验是利用碘酸钾做氧化剂。即在一定量的盐酸酸性试液中加碘化钾—淀 粉指示剂，用已知浓度的碘酸钾滴定。当碘酸钾滴入后即释放出游离的碘，此碘 被维生素 C 还原，直至维生素 C 完全氧化后，再滴以碘酸钾液时，释放出的碘 因无维生素 C 的作用，可使淀粉指示剂呈蓝色，即为中点，其反应如下： KIO + 5KI + 6HCl→6KCl + 3H O + 3 I 3 2 2 三、实验材料 柑橘或辣椒、研钵、天平、2%盐酸、0.5%KI、0.001N KIO 、1%淀粉溶液、 3 蒸馏水、100mL 容量瓶、纱布、50mL 烧杯、移液管、滴定管 四、实验方法 （一）样品液的制备 将柑橘或辣椒样品先纵切为 4-8 等分，除去不能食用部分，切碎，取 20g 作 分析用。将称取的样品放入研钵中，加 2% 的盐酸 5-10mL，研磨至呈浆状，小心 无损地移研钵中样品于 100mL 容量瓶中，研钵用 2%盐酸液冲洗后，亦倒入量瓶 中，并加2%盐酸至 100mL，充分混合，用清洁干燥二层纱布过滤入干燥的烧杯 中，滤液作测定用。 （二）样品液的分析 在 50mL 的烧杯中，用移液管注入 0.5% 的 KI 溶液 1mL，1%淀粉液 1mL， 以及上述制得的试液5mL ；再加蒸馏水至总体积 10mL。用0.001N KIO3 溶液滴 定，要一滴一滴加入，并时时摇动烧杯，至微蓝色不褪为终点（一分钟不褪为止）。 记录所用 KIO3 溶液毫升数。 同上法再测定3 次，取各次测定的平均值，按下式计算维生素 C 含量。 V × 0.088 b W = × × 100 B a W = 100 克样品含的抗坏血酸毫克数（mg/100g ）。 V = 滴定样品所用的 KIO3 溶液毫升数。 0.088 = 1mL0.001N KIO3 溶液相当的抗坏血酸的量（mg/mL ）。 B = 滴定时所用样品溶液毫升数。 b = 制成样品液的总毫升数。 a = 样品的克数。 五、思考题 1、测定维生素 C 的含量为何要在盐酸的酸性溶液中进行？ 2 、本实验产生的误差的原因有哪些？ 实验二 考马斯亮蓝法（Bradford ）测蛋白浓度 一、实验目的 学习和掌握考马斯亮蓝 G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝 G-250 （Coomassie brilliant blue G-250 ）测定蛋白质含量属于染 料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm ； 当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸 收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与 考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速； 其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法是 1976 年 Bradfo