生物细胞培养标准作业程序强场物理与超快技术试验室制作制作人.DOC

生物細胞培養標準作業程序 強場物理與超快技術實驗室 製作 製作人： 蔡昆達 更新日期：2010／05／17 大綱： 注意事項 細胞解凍程序 細胞培養程序 細胞冷凍程序 細胞計數程序 使用溶液配方 Phosphate buffered Saline (PBS ) Medium 注意事項： 在每次開始操作前，需先確認耗材存量是否足夠，及早採購預備。 所有操作步驟中，要進入生物操作櫃的物品，都必定要均勻噴灑過 70% 的酒精才可進入生物操作櫃。自己的手，需洗淨後擦乾後戴上手套，進入生物操作櫃之前，也需均勻噴灑過酒精，以下的步驟不一一註明。 開啟培養箱前後，都必須在門需要放入培養箱中的 Flask、Dish 等容器，需均勻噴灑過 70 % 酒精，才可放入培養箱。 身體不適者，於細胞操作實驗時需配戴口罩。 培養細胞過程中， Flask 的合適容量為 10 ml，Dish 的合適容量為 2 ml。 水浴槽設定溫度應為 37℃。 C02培養箱與自製培養箱的溫度設定應為37℃，二氧化碳濃度應為 5 %。 每次操作前的準備步驟： 確認水浴槽內的水足夠，水位約需達到水浴槽內壁高度的一半，若水量不夠，加入自來水至預定水位即可。開啟水浴槽開關，放入裝有培養基的容器，隔水加熱培養基，等待溫度至設定值 37℃ 備用；開啟水浴槽開關同時，開啟生物操作櫃風機並紫外光燈管電源，殺菌10－15分鐘後切換至日光燈照明。 手掌至手肘部分均用洗手乳洗淨，擦乾後戴上手套。 將需要用到的培養基、酵素等溶液，以及會用到的離心管、滴管等耗材，均勻噴灑稀釋至 70% 的酒精後，放置到生物操作櫃中，並在操作櫃中央點起酒精燈。 名詞介紹： Medium － 培養基 Fetal Bovine Serum (FBS) － 胎牛血清 Phosphate buffered Saline (PBS ) －磷酸鹽緩衝溶液 Flask － 細胞培養盤 Dish － 圓形培養皿 Pasteur pipet － 巴斯特滴管／無刻度，需自行滅菌使用，單一規格 Pipet － 滴管／有刻度，塑膠製，已滅菌，最大容量依規格而異 Bottle Top Filter (BTF) － 過濾頭／栓於玻璃瓶上使用 DMSO － 抗凍劑 Trypan blue － 藍色染劑 Hemacytometer － 細胞計數玻片 Eppendorf － 塑膠小管，容量通常為 2 ml 左右依規格不同而異 需存放的 Flask、Dish、離心管、冷凍小管等容器，都需用抗酒精的 marker 清楚標示內容物為何、操作日期、以及操作人員姓名。若是細胞繼代培養，更需註明目前的代數，以及這是同一代中的第幾盤。 文中所指的培養基一詞，均為 90% 培養基、10 % FBS 混合而成的培養液。 細胞解凍程序： 目的： 購買的細胞通常會將細胞、培養基和抗凍劑混合之後裝在冷凍小管中冷凍，將冷凍小管連同乾冰放置於保麗龍盒內寄送。此程序可以將冷凍小管解凍，開始細胞的培養。存放於液態氮桶的冷凍小管也比照此程序解凍。 操作程序： 實行注意事項 H中操作前的準備步驟。 手拿著冷凍小管管蓋處，將小管浸於水浴槽中，需注意管蓋處不可碰水，以免開蓋時外面的水汙染到細胞溶液，管蓋以下均浸於水中，此時手輕輕搖晃加快溶解速度，直至溶液內不再有冰塊。 拿入生物操作櫃中，用滴管將全部溶液轉移至一乾淨離心管中，加入新鮮培養基至 10 ml，拿到離心機以 1000 rpm離心 5 分鐘。 至生物操作櫃中用幫浦與巴斯特滴管將殘餘液體吸走，然後再加入 10 ml 新鮮培養基，用滴管以吸放的方式混合細胞與培養基溶液。 再次拿到離心機中以1000 rpm離心 5 分鐘；之後在生物操作櫃中用幫浦與巴斯特滴管抽去殘液體。 用滴管抽取 10 ml 新鮮培養基，用吸放的方式將離心管中的細胞懸浮起來之後，即可將細胞與培養基轉移至 Flask 中，將 Flask 放入培養箱中來培養。 隔日，為移除可能殘餘的抗凍劑，需用幫浦與巴斯特滴管抽取移除 Flask 中原有的培養基，用滴管再次加入新鮮的培養基 10 ml，繼續於培養箱中培養。至此完成細胞解凍培養的程序。 細胞培養程序： 目的：將培養於培養箱中的細胞進行繼代培養，或是因應實驗需求進行分盤。 操作程序： 實行注意事項 H 中操作前的準備步驟。 將 Flask 自培養箱中取出，於操作台中用幫浦及巴斯特滴管抽去所有溶液。 用滴管吸取 10 ml PBS 溶液，加入至 Flask 中，以輕微搖晃的方式潤洗細胞層，之後用相同一支滴管將 PBS 溶液吸取至一乾淨燒杯回收廢溶液。 拿取一隻新滴管，重覆步驟 3。（步驟3、4是為去除原有培養基當中的 FBS，以免 FBS 中和酵素的作用，使細胞壁上的黏附蛋白質無法被酵素分解，細胞會無法懸浮起來，無法取出細胞