数据处理胶上原位酶切直接1继续处理2继续处理3蛋白质组学研究.PPT

Molecular approaches in bioremediation Bioremediation 广义的生物修复，指一切以利用生物为主体的环境污染的治理技术。它包括利用植物、动物和微生物吸收、降解、转化土壤和水体中的污染物，使污染物的浓度降低到可接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质，也包括将污染物稳定化，以减少其向周边环境的扩散。一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型。 狭义的生物修复，是指通过微生物的作用清除土壤和水体中的污染物，或是使污染物无害化的过程。它包括自然的和人为控制条件下的污染物降解或无害化过程。 生物修复技术与其他工程措施相比,具有费用低、就地处理、对周围环境干扰少等许多优点 。 本文综述了分子方法在生物修复中的应用，着重于根际修复（rhizoremediation）及其在降解含氯乙烯（chlorinated ethenes）中的应用。 Rhizoremediation 根际的概念于1904年由Lorenz Hiltner首次提出,是指植物根系活动的影响在物理、化学和生物学性质上不同于土体的动态微域,它是植物一土壤一微生物与环境交互作用的场所。根际中根分泌物主动营造的根际微域环境是有机污染物有效性及毒性得以消减的重要原因。有别于一般土体,根际中根分泌物提供的特定碳源及能源使根际微生物数量和活性明显增加,一般为非根际土壤的5-20倍,最高可达100倍。 根际修复是利用植物一微生物和根际环境降解有机污染物的复合生物修复技术，是目前最具潜力的土壤生物修复技术之一。 Protein engineering 定向进化（Directed evolution）是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。 易错PCR是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。本法的关键在于选择适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。 费力、费时，且易出现同型碱基转换 1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNA shuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株,其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍,也远高于易错PCR的突变筛选结果。 DNA改组是DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。实际上,该技术是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。在创造新基因的过程中,要设法产生各种变异。这主要通过有性PCR、交错延伸PCR完成。 值得指出的是,DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此,灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。 DNA改组是基因在分子水平上进行的有性重组，是一种反复性突变、重组的过程。主要包括以下步骤： （1）目的DNA片段的获得； （2）目的基因的随机片段化，即将目的基因（ 可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的3’末端，从而为下一步的无引物PCR提供了条件； （3）无引物PCR，即具有互补3’末端的寡核苷酸互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环，在不同模板上随机互补结合并进一步延伸； （4）有引物PCR，即以上轮无引物PCR的产物为模板，加入基因两端序列为引物，经过多轮PCR得到重排产物的集合，称为突变文库； （5）克隆、筛选、分析及多轮筛选，即进一步对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮改组的模板，重复上述步骤进行多次重排和筛选，最终获得性状比较理想的突变体。 与常规突变技术相比，DNA改组有以下显著优点： ①DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb； ②通过多轮筛