海底及污染环境中微生物群落分子多样性研究---发展和应用以功能基因及基因芯片为基础的基因组技术体系-植物病理学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 澹帆 加秒肘日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： I l々嵋 时间： 乒叼年，2一月，8曰 导师签名： 罗宪 时间：尹州；年，2月，舅日 海底及污染环境中微生物群落分子多样性研究发展和应用以功能基因及基因芯片为基础的基因组技术体系 海底及污染环境中微生物群落分子多样性研究 发展和应用以功能基因及基因芯片为基础的基因组技术体系 摘 要 微生物在全球碳、氮、硫、磷和重金属等的物质循环中起着非常重要的作用，仅占 海底总面积22％的大陆边缘是已知的最多产的生态系统之一。反硝化作用是造成海底氮 收支不平衡的主要原因，反硝化细菌在氮的循环中起主要作用。同时，由于海底提供了 一个良好的无氧环境，使得由硫酸盐还原菌参与的硫酸盐还原成为大陆边缘一个主要的 厌氧性碳氧化途径。此外，生物治理可能是环境污染治理最有效的技术，但它与一系列 的微生物活动和代谢过程有关。因此，研究海底及污染环境中微生物的群落结构与功能 多样性是非常有意义的。 传统的微生物群落结构研究方法是以培养性状为依据，但它不能提供微生物群落多 样性准确的、足够多的信息，20世纪80年代末90年代初发展了以核酸(基因)为基础的分 子生物学技术。在这一技术的应用中，目标基因的选择是非常重要的，16SRNA或rDNA 是目前微生物多样性分析常用的基因，但它有异质性和识别力的限制以及不能直接反应 微生物的代谢与生理特征的缺陷。近年来发展了以通过微生物代谢过程中编码关键酶的 功能基因的分析来研究微生物群落遗传多样性的方法。这些方法包括基因指纹图谱法、 分子杂交法、定量PCR分析法和基因测序与系统发育分析法，它们大大地减轻了对微生 物培养的依赖性，并迅速地被广泛用于微生物群落结构分析。 目前常用的各种分子生物学分析方法都有这样那样的缺点，没有一种合适的方法可 以用来同时快速、适时、准确、灵敏地检测环境微生物群落的多样性。基因芯片是上世 纪90年代中期发展起来的一门新的技术，目前它已广泛应用于基因表达测定、突变检 测、基因多态性、基因组文库作圈、临床诊断、新药筛选等领域，但它在在环境微生物 研究中的应用尚处于起步阶段，目前已有功能基因芯片、系统发育寡核苷酸芯片和群落 基因组芯片等3种基因芯片被用于环境微生物基因表达分析、比较基因组分析和混合微 生物群落的分析。但它在环境核酸样品分析时，面临着诸如特异性、灵敏度和定量性等 难题。 在本研究中，我们以淤、n洲：和西叫B作分子标记，应用PcR扩增、克隆文库构 建与RFLP筛选以及基因测序与系统发育分析相结合的方法来分析海底和核污染地下水 环境中反硝化细菌与硫酸盐还原细菌群落的组成结构与功能多样性。并进一步构建了一 个完整地含有目前已知的生物降解功能基因探针的寡聚核苷酸基因芯片，对其检测特异 性、灵敏度和定量性能以及适用性进行了系统研究。 1．太平洋墨西哥海域大陆边缘海底亚硝酸盐还原酶基因的分子多样性 为了了解太平洋墨西哥海域缺氧区大陆边缘海底反硝化细菌群落的组成与结构，应用 PCR为基础的分子克隆方法，分析了4个海底样品中亚硝酸盐还原酶基因∞f，)的分子多 样性。在4个样品中共获得82个耐心基因的可操作分类单位(oTus)和50个，埔基因 1 的OTus，从中选择44个Ⅳ，心克隆和31个砌必克隆进行基因测序分析，月，心基因序列间的 的OTus，从中选择44个Ⅳ，心克隆和31个砌必克隆进行基因测序分析，月，心基因序列间的 同源性为52～92％，f膈基因序列间的同源性为50～99％。在月f心克隆文库中，各样品问有 18～30％的OTUs重叠，在Hf坼克隆文库中，有5～8％的OTus重叠。基因测序分析显示，26％ 的”j心克隆与爿尼口，f邸”os向ecd凰(同源性为80～94％)和风e“咖”}Dds s，，，艘，f(同源性为 80～99％)亲缘关系较近，但有3～30％的洲e克隆与Pse“如Ⅲ∞ds sp．strajn G179(同源性为 98～99％