含变形链球菌sbr基因转基因番茄防龋疫苗的研究-微生物学专业论文.docxVIP

中山大学博士论文含变形链球菌sbr基因转基因番茄防龋疫苗的研究 中山大学博士论文 含变形链球菌sbr基因转基因番茄防龋疫苗的研究 博士研究生：赵玮玮 导 师：凌均綮教授 专 业：微生物学 摘要 龋病是人类普遍感染的一种疾病，在世界范围内波及95％以上的人群，被 世界卫生组织列为危害人类健康的三大疾病之一。变形链球菌是龋病最重要的致 病菌，其中表面蛋白PAc是其重要的毒力因子之一。防龋疫苗研究从采用变形 链球菌全细胞作抗原研制灭活疫苗和减毒活疫苗开始，随后亚单位疫苗、基因工 程疫苗、多肽疫苗等相继问世，九十年代以来，PAc和GTF基因克隆和测序完 成，对这两种抗原物质蛋白质分子中各个功能区、抗原表位及相应的编码片断有 了深入了解。随着转基因植物技术的不断发展，利用转基因植物生产口服疫苗成 为研究的热点。 本研究对己获得的含变形链球菌sbr基因转基因番茄的遗传特性、安全性及 防龋效果等生物性状迸行了探讨。同时为了提高可食用防龋疫苗的有效性，在前 期研究基础上重新构建了果实特异性启动子驱动的含sbr及含sbr—ctb基因的高 效植物表达载体，并获得番茄转化体，从而为研制安全经济的可食用防龋疫苗提 供了的新途径。 第1部分含变形链球菌sbr基因转基因番茄遗传性 及免疫定菌鼠的研究 1．1外源sbr基因在转基因番茄中遗传性状及整合模式的研究 目的：初步探讨变形链球菌sbr基因在转基因番茄中的遗传分离规律，研究启动 子、目的基因、终止子的整合方式。方法：用CTAB法提取番茄基因组总DNA，PCR 中山大学博士论文方法定性检测转基因番茄当代、子一代、子二代中的sbr基因，并对子二代中的 中山大学博士论文 方法定性检测转基因番茄当代、子一代、子二代中的sbr基因，并对子二代中的 花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和胭脂氨酸合成酶nos终止子进行PCR定性检 测。结果：(1)子一代和子二代sbr基因显性和隐性比例分别为3：2和1：1，呈非孟 德尔遗传规率。(2)目的基因sbrl．7kb、sbr609kb、CaMV35S启动子和nOS终止子 的阳性检测率存在一致性。结论：外源基因在转基因植物中可以向子代遗传，启 动子、目的基因及终止子的整合存在一定的连锁性。 关键词：转基因番茄，sbr基因，CaMV35S启动子，nos终止子 1．2含sbr基因转基因番茄防龋疫苗免疫定菌鼠的实验研究 目的：观察含sbr基因转基因番茄口服免疫定菌鼠后大鼠机体免疫应答情况及疫苗防 龋效果。方法：20只大鼠随机分为2组，转基因番茄组和非转基因番茄组。每天8am 饲喂番茄，每周称一次体重，最后一次饲喂后7天，收集唾液和血清，用ELISA法 检测血清和唾液中特异性IgA和IgG抗体水平，收集上下颌骨标本Keyes计分法评估 免疫定菌鼠磨牙的忠龋情况。结果：转基因番茄组和非转基因番茄组两组大鼠唾液 和血清特异性IgG和IgA抗体及磨牙龋齿Keyes评分结果没有明显差异。结论：在本 实验的条件下含sbr基因转基因番茄免疫原性较弱，抗原特异性免疫应答不明显，防 龋效果不是很理想。 关键词： 转基因番茄，疫苗，龋病，sbr基因，IgG，IgA 第2部分新的高效植物表达载体的构建 和番茄高效再生转化体获得 目的：构建果实特异性启动子驱动的含变形链球菌sbr基因、含sbr--ctb嵌合体 高效植物表达载体，利用番茄再生转化系统获得番茄转化体，为提高可食用防龋 疫苗的免疫原性打下实验基础。方法：采用CTAB法提取中蔬5号番茄基因组 DNA，利用PCR技术扩增果实特异性启动子E8和2A11基因；将扩增的片断与 T载体连接，测序，限制性BamH I和HindlII双酶切；双酶切切下质粒pROP及 pROSC中的组成型启动予CaMV35S，凝胶回收电泳大片断，应用定向克隆技术 n 中山大学博士论文构建重组植物表达载体p2AROP、pE8．1ROP、p2AROSC、pE8．1ROSC；氯化钙 中山大学博士论文 构建重组植物表达载体p2AROP、pE8．1ROP、p2AROSC、pE8．1ROSC；氯化钙 法制各根癌农杆菌EHAl05感受态细胞，冻融法将植物表达质粒以AROP、 pE8．1ROP、p2AROSC、pE8．1ROSC转化农杆菌，获得植物二元表达载体：碱 裂解法提取农杆菌质粒后通过PCR和双酶切鉴定：利用含质粒p2AROP的农杆 菌采用叶盘转化法转化番茄子叶获得转化体，PCR法鉴定转基因植株中外源基 因2A1l和sbr基因的整合。结果：成功克隆了果实特异性启动子E8．1(1．1kbl、 E8．2(2．2kb)和2A(968bp)基因；用E8．1(1．1kb)、2A11(868bp)基因置换质粒pROP、 pROSC中的组成型启动子CaMV35S，构建了高效植物表达载体p2A