马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性保护作用.docxVIP

马尾松树皮提取物对顺苗所致体外人胚肾 细胞毒性保护作用 摘要目的：体外探讨马尾松树皮提取物(PMBE) 对顺苗所致肾毒性的保护作用，并初步探究其作用机制。方 法：体外培养人胚肾细胞HEK293,用四甲基偶氮嗟哩蓝 (MTT)方法分别检测PMBE、顺钳对HEK293细胞生长的影响, 以及PMBE对顺鉗所致HEK293细胞毒性的保护作用；并检测 各组细胞内的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH) 含量，以及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和 硫氧还蛋白酶(TrxR)的活性。结果：PMBE低浓度下促进 HEK293细胞生长，较高浓度下对细胞产生轻微毒性；顺钳抑 制HEK293细胞生长，使细胞内ROS, MDA含量升高，GSH含 量降低，同时降低SOD, CAT和TrxR酶活性;加入PMBE预 保护后，在一定范围内降低顺铀对HEK293细胞的损伤，降 低ROS, MDA含量，升高GSH含量，以及提高SOD, CAT和TrxR 酶活性。结论：一定浓度的PMBE对顺钳所致人胚肾细胞的 毒性有保护作用，其机制可能与PMBE的抗氧化性密切相关。 关键词马尾松树皮提取物；顺钳；人胚肾细胞；肾毒 性；抗氧化性 收稿日期2013-01-16 基金项目广东省工业攻关计划项目(2004bl0401033)； 广东省自然科学基金项目(S2012010010533)；中山大学教 务处教改项目(100035) 通信作者 *王宏斌，教授,Tel: (020 E-mail： wanghb@mail. sysu. edu. cn 作者简介 冯冬茹，博士， E-ma订： lssfdr@mail. sysu. edu. cn 顺钳是临床上广泛使用的化疗药物之一，但顺钳严重的 肾毒性是限制其临床应用的主要因素，机制可能与其引起的 过氧化反应有关［1-2］ o近几年的研究表明，抗氧化剂对顺 钳的肾毒害有明显的保护作用［3］。马尾松树皮提取物 (Pinus massoniana bark extracts, PMBE)的主要活性成 分是原花青素，由单体、寡聚体和多聚体等天然类黄酮组成 的混合物［4］。本实验室已经证明马尾松树皮提取物具有抗 氧化以及清除自由基的能力［5］,但是对其在顺钳肾毒性保 护上的应用还未见报道，基于此，本研究以人胚肾细胞 HEK293为研究材料，旨在重点研究PMBE是否对顺钳引起的 肾毒性具有保护作用，并初步探究其作用机制。 1材料与方法 1. 1药物与试剂马尾松树皮提取物(PMBE,由广东省 嵩珍营养研究所提供，用DMSO配成100 g?L-1的贮存液， 并用0.22 um的过滤膜过滤，-20 °C储存。使用前，用10% FBS-DMEM培养液配成不同浓度的处理液)；顺钳(TCI,日本 东京化成工业株式会社，纯度＞95. 0%,用PBS配制溶解后用 0. 22 um的过滤膜过滤，密封避光4 I保存备用)；人胚肾 细胞HEK293 (中山大学医学院动物细胞中心)；胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶、DMEM、青链霉素和维生素C(Vit CXGibco 公司)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)和过氧 化氢酶(catalase, CAT)检测试剂盒(碧云天公司)；NADPH 和胰岛素(普博公司)；MTT , DTNB和小鼠肝脏TrxR (Sigma-Aldrich)； E. coli Trx为本实验室从质粒中分离 纯化；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙 二醛(malondialdehyde, MDA)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。 1.2细胞培养 细胞用含10% FBS和1%青链霉素的DMEM 培养液培养，置于37 °C, 5% C02的培养箱中，用0.25%胰 蛋白酶消化传代，2?3d传代1次，以维持细胞处于对数生 长期。 1.3细胞存活率检测实验 顺钳对HEK293细胞的毒性作 用：取对数期的细胞，消化后吹打成单细胞悬液，以1X105 个/mL接种于96孔板。待细胞生长至融合状态，加入不同浓 度顺餡(终浓度分别为0, 0.015, 0. 030, 0. 060, 0. 120, 0. 240, 0. 480, 0. 960, 1.920, 3. 840 mmol ? L-l)o 培养 24 h后，每孔加入5 g?L-1的无菌MTT溶液20 uL,继续培 养4 h。弃去各孔的培养液，加入150 u L DMSO, 200 r ? min-1 摇床振荡10 mino多功能酶标仪上测定490 nm吸光度(A), 每个剂量设6个复孔，实验重复3次。细胞存活率二A实验 / A空白对照X 1