临床免疫学检验技术江西省胸科医院：熊国亮.pptVIP

试剂因素:抗原抗体的纯度, 抗体的亲和力、标记物的比活性或免疫活性等均对测定结果产生直接影响。试剂盒的稳定有效期, 运输条件及储存方式等也均会对结果产生一定程度影响。 ELISA检测的主要影响因素 ELISA检测的主要影响因素 标本因素:内源性物质和外源性物质干扰。内源性物质常见的有: 类风湿因子(RF)、嗜异性抗体( Id)、补体、人抗动物抗体(HAAA )、药物及其致的代谢产物和交叉反应物质等等。RF、Id 和等的干扰机制相似, 均为固相抗体和标记抗体之间的桥联抗原,在夹心法中易产生假阳性。 ELISA检测的主要影响因素 对于含有内源性干扰物的标本可以作以下处理: (1) 去除分析用抗体Fc 片段, 用F (ab) 2 替代完整的IgG, 可以减少RF、Id 和HAAA 等对分析结果的影响; (2) 用63 ℃, 10m in 或56 ℃, 30m in 热处理来减少RF 和补体等对结果的影响; (3) 用2巯基乙醇加入标本稀释液中, 可使RF 降解,用EDTA 稀释标本可缓解补体对结果的干扰; ELISA检测的主要影响因素 设备：加样系统、孵育设备、洗板机、酶标仪 环境因素：水质 操作：标本处理、加样、温育、洗板、显色、终止 设备 卫生行业标准－乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法 (WS / T 223－2002) 酶标仪在450 nm 和492 nm 的波长不精密度应在≤1 %，分别在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之间，吸光度（A 值）要求可以测到小数点后两位； 设备 移液系统在100μl和50 μl 的移液不精密度应≤1 % ，分别在99- 101μl 和49.5μl-50.5μl 之间； 恒温系统在37 ℃ 、43℃ 的温度变异应成士I℃ 。 RF多为IgM型，也有IgG和IgA型。RF具有与变性IgG产生非特异性结合的特点，因此在ELISA检测过程中可能与固相上包被的抗体及酶标抗体结合，并将这藕连起来产生假阳性结果。这种情况在利用捕获法测定IgM型抗体的过程中尤其严重。因为捕获法测定IgM型抗体试剂盒中固相上包被的抗体为抗人μ链。 内源性干扰 内源性干扰 补体: 补体经典活化途径从C1q开始, 在固相抗体和酶标抗体吸附及结合过程中, 抗体分子可能发生变构,从而使 Fc段 的补体C1q 分子结合点暴露出来, 则C1q 可将二者连结起来, 造成假阳性。 内源性干扰 可采用RF吸附剂去除RF，63℃ 10min或56℃30 min灭活补体 采用抗体的Fab段替代完整的IgG可有效避免RF干扰。 溶血：Hb含有的血红素基团具有类似过氧化物的活性，若标本中Hb浓度过高则可能吸附于固相并于随后加入的HRP底物反应显色。 外源性干扰： 外源性干扰： 细菌污染：细菌的一些内源性酶本身会对用相应酶作标记测定方法产生干扰。 标本贮存时间过长：标本在2-8℃保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深甚至假阳性。 外源性干扰： 标本凝固不全：血液采集后如收集管中促凝剂和抗凝剂，血液一般在半小时后开始凝固。在临床工作中可能因为赶时间而在血液还未凝固之前就强行离心分离血清，此时分离的“血清”可能残留有部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中形成纤维蛋白而沉积、吸附在酶标板内，而常规洗板难以完全去除。 溶血和非溶血、脂浊与非脂浊两组样品A 值无统计学意义。 AFP、RF、补体、自身抗体阳性样品的吸光度值明显高于对照组吸光度值, 具有统计学意义, 这可能是AFP、RF、补体和某些自身抗体能够与固相一抗, 标记二抗Fc 结合或影响它们的结合而造成假阳性 三种不同的温育方式均会导致边缘效应, 中央孔和周围孔的吸光度有显著性差异 但水浴法温育比较稳定, 边缘效应相对较小, 孵箱法较大, 微波法最为明显。 建议: ①使用抗凝血标本, 便于标本的离心分离。②不抗凝血液标本过夜之后才检测,让血凝块更好地收缩,让标本中的非特异性物质被充分地包裹,降低非特异性反应所致的假阳性率[2 ] 。③标本离心时,加大离心转速,延长离心时间,使红细胞和纤维蛋白充分沉降,使标本的离心分离更加彻底[3 ] ④标本加样时避免加入红细胞和/ 或纤维蛋白,避免这两种干扰物质对实验结果的影响 临床免疫学检验技术 一、概述 免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学检验领域应用的一门学科。免疫检验技术则重点阐述各类免疫学技术的基本原理、方法类型和临床应用。19世纪末相继建立了凝集试验、沉淀试验和补体结合试验等三大经典血清学试验，用于检测病原微生物的抗原或抗体对传染病的诊断起到重要作用。 一、概述 随着免疫学理论和实验技术的发展，放射免疫技术、荧