广州管圆线虫cdna文库的构建分析及广州管圆线虫病疗效考核抗原的筛选鉴定-病原生物学专业论文.docxVIP

博士擘位论史广州管圆线虫oDNA文库的构建分析及 博士擘位论史 广州管圆线虫oDNA文库的构建分析及 广州管圆线虫病疗效考核抗原的筛选鉴定 博士研究生：赵醒村 指导教师：陈晓光教授 摘要 广州管圆线虫病(Angiostrongyli8sis)是由广州管圆线虫 (Angiostrongylus cantonensis)感染而引起的．作为一种新发的食源性传染性疾 病，广州管圆线虫病在全球的流行都呈现出上升的趋势，对人类的威胁也越 来越大。广州管圆线虫主要侵犯中枢神经系统。引起嗜中性粒细胞增多性脑 膜炎或脑膜脑炎。感染该病后，绝大多数患者有头痛、肌肉痛、恶心、呕吐、 感觉异常、触摸痛、发热、畏光，视力模糊、嗜睡、颈硬等症状．其中以头 痛最突出，患者自诉。头痛欲裂”或忍受不了；全身疼痛、皮肤过敏的现象 也比较严重；个别病人还会出现精神病样症状．我国是广州管圆线虫病的主 要流行区之一，近几年的发病数逐渐增多，甚至出现了爆发流行．如何有效 地防治广州管圆线虫病已成为亟待解决的重要问题。 在广州管圆线虫病的防治工作中，诊断是关键。诊断明确，治疗及时， 则病人的转归一般良好。但目前国内外都还缺乏敏感特异、能产业化生产、 标准化的诊断试剂盒．针对目前这个难点问题，本论文进行了以下研究： 一、广州管圆线虫幼虫eDNA文库的构建与幼虫、成虫基因表达模式分析 鉴于广州管圆线虫在人体的感染和致病阶段主要为幼虫，本文构建了广 州管圆线虫脑期幼虫的eDNA文库，并用EST(expressed sequence tag)方法对其 基因表达谱和成虫的基因表达谱进行了初步分析，目的是对此新发传染病病 原的分子生物学特征进行了解和为诊断性抗原的筛选提供库源． 中文摘要从感染广州管圆线虫3周的大鼠脑部挑取幼虫，提取其总RNA，运用 中文摘要 从感染广州管圆线虫3周的大鼠脑部挑取幼虫，提取其总RNA，运用 “SMARTeDNA文库构建试剂盒”构建其eDNA文库。所建文库的初始滴度为 2．19x106 pf-u／ml，经1次扩增后的滴度为1．0x10mpfu／ml，插入子的平均长度为 1．2kb，重组率为97．3％． 分别将成虫eDNA文库(由中山医科大学寄生虫学研究所构建)和我室构 建的幼虫eDNA文库中的噬菌体克隆转化成噬菌粒，用5、端测序引物进行测序。 利用BLAST程序对获取的EST从核苷酸和氨基酸水平进行同源性搜索，对成虫 和幼虫的表达模式进行了分析。从成虫的eDNA文库中得到“个EST，其中与 其它基因有同源性的EST有54个，占82．8％；没有同源性的EST有10个，占 17．2％。64个成虫EST序列中。rRNA基因49个，占总EST数的76．6％．从 幼虫的cDNA文库中共得到106个EST，其中与其它基因有同源性的EST有91 个，占85．8％；无同源性的EST有15个，占14．2％。106个幼虫EST序列中rRNA 基因78个，占总EST数的73．6％。本研究首次成功构建了广州管圆线虫幼虫 的eDNA文库，EST分析显示广州管圆线虫幼虫和成虫基医表达谱中rRNA基 因均占大多数。 二、广州管圆线虫新基因的发现及初步研究 应用EST策略，我们从广州管圆线虫脑期幼虫eDNA文库中筛到了两个包 含全长读码框的eDNA序列G40基因及G172基因，并已在GenBank中登录(登 录号分别是DQ384534及DQ384535)。G40及G172基因分别与秀丽杆线虫半凝 乳素．8及胶原蛋白140高度同源。从保守结构域的搜索结果可知，G40具有半 凝乳素结构域，该结构域能专一性地与13．半乳糖苷结合，如乳糖，而不需要金 属离子的活化。半凝乳素以二聚体或三聚体结构域存在，它们进程性地受到调 节，还可能参与了细胞分化、细胞与细胞的相互作用及细胞调节．G172基因编 码的蛋白经保守结构域的搜索，没有发现有已报道的结构域。G40及G172基因 Ⅱ 博士学位论文分别用pET32a(+)质粒在BL21大肠杆菌中表达，G40基因的表达产物与感染大 博士学位论文 分别用pET32a(+)质粒在BL21大肠杆菌中表达，G40基因的表达产物与感染大 鼠血清有明显的免疫反应性，是种具有潜力的诊断用抗原，而G172基因在 pET32a(+)／BL21系统中不表达。可能与该蛋白对细胞具有毒性有关． 三、广州管圆线虫病疗效考核大鼠模型的建立 本研究从褐云玛瑙螺中分离m期幼虫，以50条，只腹腔接种感染SD大鼠。 于治疗前从各组分别抽取感染鼠解剖观察广州线虫的感染情况，确定各组大鼠 均感染成功后，用50、100和200mg／kg／d 3个不同剂量的阿苯达唑分别对感染 大鼠进行连续3天的治疗。 为保证感染大鼠能得到有效的治疗，采用了3个不同剂量的阿苯达唑分别 对感染大鼠进行治疗，但21w后仍有