广州管圆线虫未知基因的筛选和功能研究及中间宿主调查-病原生物学专业论文.docxVIP

广卅l管圆线虫未知基凼的筛选和功能研究及中间宿主调查 广卅l管圆线虫未知基凼的筛选和功能研究及中间宿主调查 中文摘要 广州管圆线虫未知基因的筛选和功能研究 及中间宿主调查 专 业： 病原生物学 博士研究生： 孟锦绣 导 师： 詹希美教授 摘要 广州管圆线虫(Angiostrongy]us c舢tononsis)最早是由陈心陶于1933年首 次发现并命名的。其中间宿主为螺蛳、蛞蝓和蜗牛等软体动物，终末宿主为鼠类， 人是非正常宿主。当人食入了生的或未煮熟的带虫中间宿主，或吃了受到广州管圆 线虫三期幼虫污染的蔬菜、水果而感染时，引起广州管圆线虫病，临床主要表现 为嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎和脑膜脑炎。 广州管圆线虫病主要流行在东南亚及太平洋沿岸的国家和岛屿，在北美洲、 澳大利亚如悉尼、欧洲国家如瑞士等地均出现过病例报道。我国最早在台湾发现 了首个病例，至今黑龙江、辽宁、天津、广东、福建和浙江等地都陆续有过病例 报导，并呈现逐年增多的趋势，在浙江和福建两省发生多次暴发流行情况。 随着人们对生、鲜和烤制食品的偏爱，该病作为食源性寄生虫病越来越危害 到人民的健康，引起了我国卫生部门和世界卫生组织对该病的高度重视。卫生部 在2003年将广州管圆线虫病列为我国“新发传染病”，2005年又警告人们警惕包括 广州管圆线虫在内的严重威胁人类健康的食源性寄生虫病。在新出现的全球性威 胁的传染病中有三种属寄生虫病，广州管圆线虫病就是其中的一种。但是到目前， 该病在诊断、治疗以及广州管圆线虫致病机制方面的研究都很有限。 广州管圆线虫病诊断的金标准是在患者脑脊液中查到虫体，但该检出率仅为 10％一44％。经过众多学者的研究表明，用广州管圆线虫的特异性抗原来检测外周血 中的抗体是非常可行的辅助检测手段，但至今这些特异性抗体的来源还只限于虫 广州管圆线虫未知肇凼的筛选和功能研究及中间宿主调查 广州管圆线虫未知肇凼的筛选和功能研究及中间宿主调查 中文摘要 体粗抗原、虫体可溶性抗原和虫体蛋白组分。虫体蛋白组分的特异性较好，但此 类抗原不易分离，对于不容易获得的虫体来说抗原来源就更为有限。虫体抗原的 处理批次间难以达到一致，使广州管圆线虫病一直未有理想的的诊断方法。 由于人们对广州管圆线虫的关注是近几年的事，所以在广州管圆线虫致病机 制和药物研究方面的报道非常有限。寄生虫代谢特点一直是了解寄生虫的致病机 制，研究抗寄生虫药物的基础和依据。其中，寄生虫的能量代谢为虫体发育、繁 殖及适应不同环境需要提供能量来源，不同寄生虫在与外界环境相互适应的过程 中也形成了具有各自特点的代谢方式，为研究寄生虫的致病机制和抗虫药物提供 了着手点。 广州管圆线虫病在儿童病死率较高，在成人可留下严重的后遗症，但目前没 有针对该病的特效药，主要是对症治疗。因此作为食源性寄生虫病的广州管圆线 虫病防重于治。广州管圆线虫病流行三环节的传染源、传播途径和易感人群中， 传染源的控制显得尤为重要。只有通过流行病学调查明确主要传染源(中间宿主 螺)的分布、种类及感染程度等才能为有效控制该病的发生、防止暴发流行提供 参考依据。 本研究从以上三方面问题出发，在广州管圆线虫成虫cDNA文库构建的基础上 开展了以下研究工作： 1．在用EST方法筛选广州管圆线虫成虫eDNA文库的过程中，发现一全长 的丰度表达基因GAMMA—BBH，是为广州管圆线虫未知基因。生物信息学分析该 基因是脂肪酸B一氧化限速酶一肉碱合成的关键酶，其表达水乎能反应脂肪酸 B一氧化代谢水平。脂肪酸代谢在线虫代谢中比其它寄生蠕虫有更重要的地位， 它与线虫的生长发育关系紧密。作者将该基因亚克隆入原核表达载体， Western—blot结果证实正确表达了该基因。酶学研究表明该重组基因表达产物 具有较好的GAMMA—BBH酶催化活性，因此作为合成L一肉碱的转化酶，具有相当 的经济应用价值。 同时，采用实时荧光定量PCR的方法检测不同虫龄虫体中GAMMA—BBH的表 达水平，结果发现随着广州管圆线虫虫龄的增长GAMMA—BBH的表达量逐渐增加， 在第30天后的成虫体内其表达量达到高峰，随后表达水平显著下降，而在第 87天时表达又呈现高水平。表明，脂肪酸0一氧化贯穿了广州管圆线虫寄生终 II 广州管圃线虫未知基冈的筛选和功能研究及中间宿主调查 广州管圃线虫未知基冈的筛选和功能研究及中间宿主调查 中文摘要 宿主体内的全过程，脂肪酸代谢特点和规律与虫体寄生部位和致病机制可能有 关。另一方面，GAMMA—BBH的表达水平与广州管圆线虫的生长、发育有一定规 律和特点，如果破坏了这种关系能够阻止或影响广州管圆线虫的发育或生长， GAMMA-BBH可望成为抗广州管圆线虫药物的新靶点。 2．为了获得广州管圆线虫特异性诊断抗原，用感染血清作为免疫探针来筛选 广州管圆