植物体细胞杂交经典教程.ppt

www.PPTOK.com www.PPTOK.com www.PPTOK.com www.PPTOK.com www.PPTOK.com www.PPTOK.com www.PPTOK.com www.PPTOK.com 植物体细胞杂交的研究进展 班 植物体细胞杂交技术 1、植物原生质体的分离 植物原生质体的分离方法有机械法和酶解法2种， 机械法是切割或磨碎质壁分离的细胞从而释放出原生 质体的方法，一般适用于像洋葱的鳞片、黄瓜的中皮层、 甜菜的根等具有较大的、高度液泡化的细胞。酶解法是 利用细胞壁降解酶分解植物细胞壁从而获得原生质体 的方法。当酶解法有副作用时，可以考虑使用机械法， 机械法可以避免酶制剂对原生质体的破坏作用曰。但 目前机械法基本被摒弃不用而通用酶解法。酶解法可 以有效分离出大量的植物原生质体，并且适用于几乎所 有的植物。但是酶制剂中往往含有一些核酸酶、蛋白 酶、过氧化物酶以及酚类物质，所以使用酶解法会对所 得原生质体的活力有一定影响。因此，使用酶解法分离 植物原生质体要注意根据不同植物种类、不同器官的不 同细胞壁结构与成分选择合适的酶类和酶浓度。 由于植物细胞壁的主要成分相同，酶解使用的酶类基本为纤维素酶和果胶酶，或者搭配半纤维素酶、崩溃酶等复合酶类。一般而言，纤维素酶的浓度范围为1%一2%，果胶酶浓度范围为0. 5%一1 .0%,酶解pH一般为5 .5一5 .8,酶解时间从几小时到几十小时不等，但一般以不超过24 h为宜。在酶溶液里添加浓度为0. 35 一0. 80 mol/L的甘露醇、山梨醇等物质作为渗透压稳定剂可以保持细胞原生质体的稳定与活力;酶溶液中加入2-吗琳乙磺酸(MES)等作为pH缓冲剂，加入CaClz，浓度范围为0. 1一10. 0 mmol/ I,葡聚糖硫酸钾或聚乙烯毗咯烷酮(PVP)等作为质膜稳定剂可以提高原生质体的活力与 产量。另外，添加牛血清蛋白可以减少或防止降解细胞壁过程中对细胞器的破坏。 Bard-Elden等在分离甜菜原生质体时的酶液配比为2%纤维素酶+1%果胶酶+1%半纤维素酶，酶解18 h,得到的原生质体有良好的产量和活力。陶茸等叫分离扁稽豆愈伤组织原生质体时的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0 5%果胶酶+0 3%半纤维素酶，酶解时间为12 h,添加甘露醇浓度为0 .55 mol/I, Huang等在分离黄瓜原生质体时酶液组合为15%的纤维素酶+0.4%离析酶+0 .4 mol/ I二甘露醇+20 mmol/ I MES +10 mmol/ L CaClz +0 1%牛血清白蛋白，在pH为8条件下酶解8h，得到的原生质体生存能力是90%左右。 2.原生质体的融合 化学融合法 NaNO?融合法和高pH高Ca离子融合法由于融合率不高并未被后人更多的使用。相对于前2种方法，PEU融合法具有异核体形成频率高、重复性好、毒性低的优点。后来人们把PEU融合法与高pH高Ca离子融合法结合了起来，发现这样会有更高的融合率，而PEU高Ca离子高pH融合法也因此被流传下来并被广泛应用。赵小强利用PEU高Ca离子高pH融合法得到草地早熟禾种间体细胞杂种，最佳融合条件为PEU -6000浓度为35%，融合率为9.8%;同样使用此法，李玉珠将清水紫花首稽和里奥百脉根愈伤组织分离的原生质体融合，异源融合率为3. 1%，此时大多数融合体可存活并持续分裂;弈德磊在融合桑树原生质体时使用此法也得到良好的效果。 20世纪90年代发展起来的微流控芯片技术在细胞研究上有广泛的潜力，已引起人们极大的关注。2010年，武恒研究设计了一个微流控芯片，并首次采用PEU化学融合的方法，实现了小白菜无菌苗子叶原生质体及烟草叶肉原生质体的芯片内融合;Hu等介绍了微流控芯片的细胞电融合，总结了微流控芯片的细胞电融合具有操控精准，细胞配对和融合的效率高，细胞活力高，较低的样品污染，焦耳热效应较小的优点，同时详细讨论了微流控芯片电融合的一些重要参数与微流控芯片上的细胞分离和培养。 3.杂种的筛选与鉴定 杂种细胞的筛选 原生质体经刺激融合后会产生多种类型的杂合子，需要对这些杂合子进行筛选，从中选出预期的杂种细胞。目前常用的选择方式主要有利用选择培养基、利用代谢性抑制剂、互补选择法、利用物理性差异辨别和挑选杂种细胞。试验当中一般利用物理性差异使用活性荧光染料如荧光素双醋酸醋、轻基荧光素等对不同亲本进行染色或荧光标记，这样可以明显、高效的区分出杂种细胞。而绿色荧光蛋白(UFP )作为一种标记物具有检测方便、荧光稳定、通用性强、分子量小、对细胞无毒害、可进行活细胞实时定位观察等优点，日趋被人们重视与应用。U