病理学常用新技术原理与应用NewTechniques.pptVIP

八章病理学常用新技术原理及应用  病理学的发展离不开病理技术的进步，纵观病理学的发展史，从器官病理学、细胞病理学、超微病理学、免疫病理学、分子病理学、远程病理学及当今的计算机网络信息病理学。每一个发展阶段都有新技术的革命。新技术使我们对疾病认识更加深入切实。从大体、细胞、超微结构、分子基因水平逐步深入，正如病理学前辈们所说：技术是病理学之母。 病理学技术包括传统病理学技术和现代新技术。有人体病理学技术和实验病理学技术，二者相互渗透，互为促进，传统的福尔马林固定、石蜡切片、HE染色是病理学的基本技术，已广泛应用于基础和临床病理学工作。根据科研的发展，临床病理学的需要，又不断产生新的技术。作为当代的医学生，要适应技术的发展进步、了解病理学研究和临床实践中的一些新技术是必不可少的。现介绍一些新技术方法，供同学们在以后的学习工作中参考。 第一节 组织与细胞化学检查 组织与细胞化学检查（Histochemistry and cytochemistry examination）是研究组织与细胞显微结构和超微结构的化学组成及其定位的科学。主要研究对象是生物大分子（如核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等）在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。 细胞化学方法能够对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究，包括悬浮胸腹水细胞、血液细胞以及体外培养细胞均能产生同样良好的效果。目前，用细胞化学技术所能显示的化学成分有蛋白质（显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）、糖类（如糖原、粘多糖和糖脂等）、脂类（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、酶（包括水解酶如磷酸酶）、特异抗原（其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、无机盐和微量元素（如铁、铜、锌、钻、镁等）。 细胞化学染色的原理是细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物。常见有： 1．孚尔根反应法（Feulgen reaction）显示DNA呈现紫红色。 2．甲绿-派郎宁法（Methyl Green-Pyronin method）显示核酸（甲绿染DNA呈现绿色，派郎宁染RNA呈现红色） 3．苏丹Ⅲ冰冻切片染色显示中性脂肪呈现橘红色。 4．普鲁士蓝反应显示组织中含铁血黄素。 5．过碘酸雪夫反应（Periodic acid schiffreaction, PAS）显示糖原和其它多糖物质为紫红色。 第二节 免疫组织与细胞化学检查 一、原理与方法 免疫组织与细胞化学检查（Immunohistochemistry and immunocytochemistry examination）是从组织与细胞化学方法衍生出来的。是在单克隆抗体技术产生后，利用免疫学原理，将抗原抗体反应应用与组织细胞化学而进一步通过级连放大，增加敏感性。最后用辣根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原（蛋白 多肽、酶）等多种基因产物的特异方法。在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。 其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。 图 GFAP阳性神经胶质细胞 图 体外神经胶质细胞培养免疫组化GFAP阳性 二、免疫组织化学技术的主要步骤与常用标记物 （一）主要步骤 1．提取抗原(免疫原Immuno-gen); 2．用免疫原免疫动物(兔)制备抗血清(多克隆抗体) 或免疫动物(鼠)后，用杂交瘤技术制备单克隆抗体； 3．纯化抗体； 4．抗体标记组织切片； 5．染色反应； 6．观察结果。 （二）常用标记物 1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：①底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后，不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）。 3．生物素 其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。 三．常用免疫组织化学染色方法 （一）直接法 将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一抗体上，以检查相应的抗原。直接法具有特异性强的优点，但敏感性差，耗费抗体多。 （二）间接法 先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体， 二抗仅有种族特异性。 特点: ⑴ 预先标好二抗，较方便； ⑵ 比直接法敏