靶的选择和试验设计.doc

（一）靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB ( HYPERLINK http://medgen.ugent.be/rtprimerdb http://medgen.μgent.be/rtprimerdb),PrimerBank ( HYPERLINK /primerbank/index.html /primerbank/index.html) Real Time PCR Primer Sets ( HYPERLINK / )2.如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer( HYPERLINK / )B.DIY的软件Primer ExpressC.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys HYPERLINK / )的服务方案,详细周到D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: HYPERLINK /products/probe_design.asp /products/probe_design.asp 您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR 3.引物设计简介DNA引物长度:15-25 个碱基GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:10 kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则:正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右 4.输入靶序列，用BLASTn在 HYPERLINK /blast /blast进行比对5.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增使的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域 （二）反应体系 （1）本实验室 2×SYBR Green(Roche) 10μL 10uM Primer forward/reverse 0.6/0.6μL DNA template 1μL dH2O 7.8μL total 20μL （2）Wang-Lab体系（3复管，各20μL） 5X Mix 12μL 10 mM dNTP 1.5 μL Primer1+2 0.5 μL Tag 0.3μL ddH2O 16μL 30 μL cDNA (diluted for 40 folds) （三）反应条件 95℃ ×40个循环 95℃ 30 ×40个循环 60℃ 30s 各基因反应体系及条件不同，请根据实验调整 （四）结果计算 各基因的样品分别稀释10倍和100倍，用未稀释组Ct、1/10组Ct、1/100组Ct 与log21, log21/10, log21/100值计算标准曲线方程，用此方程算出该基因样品的Ct校正值用于后续计算。 Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。采用相对定量方式表示各样品的ΔCt，△Ct=Ct目的基因-Ct 内参基因。再依据△△Ct=ΔCt实验组目的基因一△Ct 对照组目的基因，计算2-ΔΔCt。2-ΔΔCt即为目的基因的组间差别（即表达相差倍数），2倍以上为有差别。