过表达carAB和pyrBI对大肠杆菌发酵胞苷的影响.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（２）：３９４４ 过表达ｃａｒＡＢ和ｐｙｒＢＩ对大肠杆菌发酵胞苷的影响 吴晓娇　孙家凯　霍文婷　谢希贤　徐庆阳　陈　宁 （天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部及天津市重点实验室　天津　３００４５７） 摘要　为了考察氨甲酰磷酸合成酶和天冬氨酸氨甲酰转移酶对大肠杆菌发酵生产胞苷的影响， 以Ｅ．ｃｏｌｉＡ３９（ ｃｄｄ）基因组为模板克隆ｃａｒＡＢ和ｐｙｒＢＩ并与载体ｐＳＴＶ２８连接构建出重组质粒 △ ｐＳＴＶ２８ｃａｒＡＢ和ｐＳＴＶ２８ｐｙｒＢＩ，将这两个重组质粒分别转入出发菌株Ａ３９（ ｃｄｄ）后，通过摇瓶 △ 发酵研究重组质粒对菌体的生长、胞苷和尿苷产量及副产物乙酸积累的影响。结果显示，工程菌 Ｅ．ｃｏｌｉＡ３９ＡＢ和Ａ３９ＢＩ的胞苷产量分别为５８３．５ｍｇ／Ｌ、４０８．４ｍｇ／Ｌ，与出发菌株相比，分别提 高了８５．３％、２９．７％。这说明过表达操纵子基因ｃａｒＡＢ和ｐｙｒＢＩ均可促进胞苷的积累。 关键词　ｃａｒＡＢ　ｐｙｒＢＩ　胞苷　发酵　过表达 中图分类号　Ｑ７８６ 　　胞苷作为嘧啶核苷的一种，是人体和动植物体内 在前期实验中，我们利用 Ｒｅｄ重组系统敲除了胞苷脱 ＲＮＡ的结构组成部分，在生物体的生理生化过程中起 氨酶基因ｃｄｄ，切断了胞苷分解为尿苷的代谢途径，在 着重要作用；同时，胞苷又是很多抗病毒、抗肿瘤药物 此基础上，本文通过在生产菌Ｅ．ｃｏｌｉＡ３９（ ｃｄｄ）内过 △ ［１２］ 的中间体以及基因工程研究的重要原材料 。随着 表达ｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢＩ，研究其对菌体生长、耗糖、胞苷合成 对抗病毒、抗肿瘤、治疗艾滋病药物研究的深入，对天 及副产物乙酸积累等方面的影响，从而为以后胞苷生 然胞苷的需求量也与日俱增，人们迫切期望得到一种 产菌的进一步选育奠定基础。 ［３］ 廉价的、能大规模、专一性生产胞苷的方法 。微生物 １　材料和方法 发酵法生产胞苷，具有成本低、产率高、周期短和易控 ［４］ １．１　菌株和质粒 制等优点 ，是大规模生产胞苷的首选技术。因此选 ｒ ｒ 育胞苷高产菌株，对提高我国核苷发酵在国际市场上 　　Ｅ．ｃｏｌｉＡ３９（５ＦＣＲ ＋５ＦＵ ＋ ｃｄｄ），Ｅ．ｃｏｌｉ △ 的竞争力有着重要意义。经传统诱变方法选育的菌株 ＤＨ５，质粒ｐＳＴＶ２８（氯霉素抗性），天津科技大学代谢 α ［５］ 会产生大量次级突变，造成菌体生长缓慢等弱点 ，是 工程研究室保存。 目前工业生产中难以解决的问题；而利用基因工程手 １．２　试剂与仪器 段改造的菌株，因其无次级突变、改造目的性强、实验 　　ＴａｑＤＮＡ聚合酶、限制性 内切酶、质粒载体 ［６］ ｐＭＤ１８Ｔ购于ＴａＫａＲａ公司；ＰＣＲ引物由华大基因合 周期短等优势逐渐受到人们的重视 。 　　在大肠杆菌中，谷氨酰胺和天冬氨酸是胞苷生