三七蛋白的提取和体外免疫调节活性研究何慧楠睢博文刘莉齐滨赵.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT 1 三七蛋白的提取和体外免疫调节活性研究 何慧楠 睢博文 刘莉 齐滨 赵大庆 （长春中医药大学，吉林 长春） 摘要:目的 提取三七蛋白，并研究其对小鼠巨噬细胞的免疫调节活性。方法 采用中性盐缓冲溶液提取三七蛋白，采用lowry法测定蛋白含量并利用SDS电泳法测定三七蛋白的亚基分子量分布。以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型研究三七蛋白对细胞吞噬能力的影响，刺激产生NO含量，释放IL-6、TNF-α来考察其对巨噬细胞免疫活性的影响。结果 用lowry法测定三七蛋白的蛋白含量为1.95 mg/mL，三七蛋白的亚基分子量从18kD 到 63kD。三七蛋白可通过增强巨噬细胞吞噬能力，释放免疫因子等方面增强巨噬细胞免疫活性。 关键词:三七蛋白；巨噬细胞；免疫调节 三七为五加科植物三七（Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen）的干燥根及根茎。三七被人们称为“金不换”，具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效[1]。三七中的化学成分复杂，主要包括皂苷类、挥发油类、氨基酸类、黄酮类、糖类、蛋白质及多肽、无机盐类等[2-6]。现代药理学研究表明，三七具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血糖等活性，并对其他药理活性起着协同调节作用[7- 9]。三七中的皂苷成分被认为是三七的主要活性成分，但是近年来的研究表明，三七多糖等大分子也具有明显的生物活性[10-12]，而这些大分子往往被人们所忽视。本研究针对三七当中的大分子物质蛋白质进行提取和性质检测，并以小鼠巨噬细胞为研究对象，对三七蛋白体外的免疫调剂活性进行初步的探索研究，为把三七蛋白开发成保健食品的原料提供科学的依据。 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 DMEM培养基，购于Gibco公司，MTT，购于Thiazoly公司，DMSO，天津天泰精细化学品有限公司，TNF-α酶联免疫测定试剂盒、IL-6酶联免疫测定试剂盒，购自上海朗顿生物科技有限公司，脂多糖（LPS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS） 均购于 Sigma 公司。Infinite 200 Pro型酶联免疫检测仪，购自瑞士TECAN公司，3111型CO2培养箱购自Thermo Forma公司。 1.2细胞株 小鼠巨噬细胞样细胞株 RAW264.7（ATCCTIB-71），购买于购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。 1.3实验方法 1.3.1三七蛋白的提取 称取粉碎后的三七粉500g，加入浓度为0.01mol/L，pH9.0的Tris-HCl缓冲溶液5000mL，4℃浸提，浸提24h后，用绢布过滤浸提液，滤渣加入5000mL Tris-HCl缓冲溶液（0.01mol/L，pH9.0）4℃浸提24h，用两层绢布过滤浸提液，合并浸提液，4000r/min离心20min，收集上清。用中空纤维膜过滤系统超滤（0.45um）和微滤（MW10000）浸提液，收集大分子滤液，向滤液中缓慢加入(NH4)2SO4，使饱和度达到75%，4℃沉淀12h后，4000r/min离心20min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，透析（MW8000），冻干，即得三七总蛋白（NGP）。 1.3.2三七蛋白的含量测定 采用lowry法测定蛋白含量，按照试剂盒使用说明书测定三七蛋白的含量。 1.3.3三七蛋白分子量分布测定 采用SDS电泳测定三七蛋白的亚基分子量分布。 1.3.4细胞吞噬能力实验 取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液，细胞密度为6×105个/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养6h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20μL，补加80μL培养基，每个浓度设6个复孔，空白组以同体积无菌PBS代替，阳性对照组加入同体积20μg/mL LPS，培养24h。用中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力，每孔加入100μL 0.075%的中性红溶液，继续孵育1h后，吸出孔内培养基，用PBS吸去残留中性红，加入150μL90%乙酸乙醇裂解液，充分混匀，测定每孔在550nm处的光度值（OD）。 1.3.5 NO含量检测 取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液，细胞密度为2×106个/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养6h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20μL，补加80μL培养基，每个浓度设6个复孔，空白组以同体积无菌PBS代替，阳性对照组加入同体积20μg/mL LPS，培养24h。采用Griess法测定NO含量：标准孔加入浓度为100μmol/L的亚硝酸0、10、20、30、40、50μL，加蒸馏水补足50μL，样品孔分别加入各组培养基50μL，之后再加入50μL Griess试剂，振摇10min