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分子育种（Molecular Breeding) 利用基因工程技术、原理和设备，在分子水平上改良生物材料。 主要体现在： ※增加生物合成基因量而增加抗生素产量 ※导入强启动子或抗性基因而增加抗生素产量 ※经体外重组产生杂交抗生素 ※激活沉默基因，产生新的生物活性物质 对工业生产有重要意义的是：基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物活性和产物的分离纯化。 因此，进行基因表达设计时，必须考虑各种影响因素，选择最佳的基因表达系统。 3） 基因工程菌的稳定性 研究发现，工程菌在保存及发酵生产过程中表现出不稳定性，结果是得不到预期的目的基因的产物或产量很低。解决工程菌的稳定性问题，已日益受到重视，并成为基因工程技术成就转变为生产力的关键问题之一。 工程菌不稳定性的表现 质粒的不稳定 分裂不稳定（质粒丢失） ——环境或生理、遗传学的原因 结构不稳定（重组质粒的DNA片段脱落） ——质粒变小或某些遗传信息变化甚至丢失 （在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率往往小于不含重组质粒的菌株的比生长速率） 表达产物的不稳定：人干扰素工程菌随着培养时间的延长，干 扰素活性下降 解决工程菌不稳定性的对策（一） Ⅰ.组建合适载体：在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因以增加传代时的质粒稳定性 Ⅱ.选择适当宿主：重组质粒在大肠杆菌中相比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。（重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。 ） Ⅲ.施加选择压力（阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长，从而消除发酵生产过程中重组质粒的不稳定） a)抗生素添加法 b)抗生素依赖变异法 c)营养缺陷型法 解决工程菌不稳定性的对策（二） Ⅳ.控制基因过量表达 研究发现，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。 两阶段培养法 诱导性启动子 解决工程菌不稳定性的对策（三） Ⅴ.控制培养条件 克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳定性和表达效率影响机制错综复杂，而众多的环境因素中，培养基组成、培养温度和菌体的比生长速率三方面尤其重要。 Ⅵ.对宿主细胞生长速率进行改良（质粒构建时实现） Ⅶ.避免所使用的质粒中带有可转移因子 Ⅷ.尽量除去质粒上不需要的DNA部分 Ⅸ.固定化 解决工程菌不稳定性的对策（四） 2.2.6 抗噬菌体菌株的选育 什么是噬菌体？ 噬菌体(phage)是一种感染细菌或放线菌的病毒。 噬菌体有两类： 烈性噬菌体：感染宿主细胞后，立即引起细胞裂解 温和性噬菌体：感染细胞后，并不马上引起细胞裂解，而是以“原噬菌体”方式整合在宿主的DNA中，随寄主繁殖而延续传代。 带有原噬菌体的菌株称为溶原性菌株。 原噬菌体不同于营养期的噬菌体，它没有感染性，对宿主一般无不良影响，但是： ☆溶原性菌株具有产生噬菌体的潜在能力：溶原性菌株培养时，少数会自发脱离染色体，导致细菌裂解。而在某些物理化学因素（UV，X射线，氮芥等）刺激下，原噬菌体会脱离染色体，开始复制，从而导致溶原性菌株裂解，产生大量的噬菌体。 ☆对同一类型噬菌体具有免疫性：溶原性菌株对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感，这些噬菌体虽然可以进入溶原性菌株，但不能增殖，也不能导致溶原性菌株裂解。 经典育种方法：自然选育、诱变育种 较定向的育种方法：杂交育种、原生质体 融合、基因工程 优良生物材料选育的技术手段： 2.2.1 自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用生物材料的自然突变进行生物材料筛选的过程叫做自然选育。 自然突变：某些微生物在没有人工参与下所发生的突变 原因：多因素低剂量的诱变效应 互变异构效应 （据统计，碱基对发生自然突变的几率约为10-8~10-9) 结果：生物材料退化 对生产有益 优点：简单易行，纯化生物材料，防止生物材料退化，稳定生产，提高产量 缺点：效率低，进展慢 自然选育（自然分离）的一般程序： 制备菌悬液 分离单菌落（稀释法） 测定单菌落生产能力 自然选育 2.2.2 诱变育种 发酵工