生物药物分析与检验 第三章 免疫分析法.pptVIP

双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。 它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 ? ?? ? 实验原理 双抗体夹心法 酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。 具有酶促反应，显示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶 一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应 一、光度酶联免疫分析 1、酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； ③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体起反应； ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例； ⑤加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。 2、ELISA的固相载体 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。 最常用的是聚苯乙烯。 聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 ELISA载体的形式有小试管、小珠和微量反应板。 3、固相载体的包被与封闭 （1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体上的过程。 以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液（或pH 7.2的磷酸盐缓冲液，pH 7～8的Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔，置4℃过夜，洗涤即可。 包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。 一般蛋白质的包被浓度为0.1～20μg/ml。 （2）封闭（blocking）指继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 所有的ELISA固相载体均需封闭。 常用封闭剂有0.05%～0.5% BSA；10%小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（5%）。 4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液 （1）稀释液用于稀释酶标抗体及标本。 常用中性PBS或Tris-HCl缓冲液，其中含有无关高浓度蛋白（如10％动物血清、1％BSA（牛血清白蛋白）、1％明胶等）和非离子型表面活性剂（如0.05％Tween 20或TritonX-100等）。 （2）洗涤液一般与稀释液相同，常用PBS或Tris-HCl缓冲液。 四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表7-2。 编号 吐温20/% 组成 稀释液 1 0.05 PBS 0.01mol/L，pH 7.4 2 PBS 0.05mol/L，pH 7.4 3 PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含EDTA 10mmol/L 4 PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含EDTA 10mmol/L 洗涤液 1 0.1 PBS 0.01mol/L，pH 7.2 2 PBS 0.01mol/L，pH 8.0 3 Tris-HCl缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L 表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液 （3）酶反应终止液 辣根过氧化物酶（HRP）反应终止液为2mol/L～4mol/L H2SO4（HRP在酸性条件下丧失酶活性）。 很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶，用3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。 5、ELISA法常用酶的底物系统 ELISA法对底物的要求： 价廉易得、安全； 显色性和稳定性好； 底物本身最好为无色物质； 终止酶催化反应后，底物不应再继续地自发性变性； 其最终产物可溶、易于测定及光吸收值高。 脱盐 蛋白质用盐析沉淀