第四章 免疫球蛋白.pptVIP

2.酶联吸附免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 属于非均相免疫分析的代表，普遍应用于各领域。 基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。 1）双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检样品，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 获得待分析物的未标定抗体 将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定 2）间接法 方法：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相上抗原结合的受检抗体 应用： 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 1 2 3）竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） (二)抗体多样性机制: 1.组合多样性：Ig基因库中众多V、D、J、C基因家族成员极端多样性的排列组合； 2.连接多样性：基因重排过程中可出现不同的连接点； 3.体细胞突变：已成熟的B细胞受抗原刺激后，在发育过程中重排基因所发生的突变。 4. L链H链相互随机配对。 多肽链 基因片段数 V区基因重组方式 重排和随机配对后推算的多样性数目 V D J H链 1000 12 4 V-D-J 48000 κ链 250 - 4 V-J 1000 小鼠Ig多样性（举例） 第五节 抗体的应用——免疫学检测 免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法。 具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点。 抗原抗体反应的特点 特异性 抗原抗体反应的可见性 适当的比例和浓度 可逆性 应 用 1、利用已知抗原检测未知抗体 （1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 （2）检测自身抗体——诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等。 2、利用已知抗体检测未知抗原 （1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原; 抗原或抗体的检测方法 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 （一）凝集反应（agglutination） 颗粒性抗原（红细胞、细菌等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。 1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、试管凝集 细菌的鉴定和血型的检查 一、 传统免疫分析 2、间接凝集（indirect agglutination） 可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应 抗体混合出现的凝集现象。 检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体 （二）沉淀反应（precipitation） 可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。 多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。 免疫比浊法 1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。 环的直径与抗原含量成正相关 2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）： 抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。 一致 部分一致 不一致，有多种成分 3、免疫电泳（immunoelectrophoresis） 常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。 ?????????????????????????????????????????????????? 1）简易免疫电泳 先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线， 2）对流免疫电泳(counte