课件：第七章放射免疫分析技术和免疫放射分析技术.ppt

二、IRMA法分类 经典的IRMA法时待测抗原或标准品先与过量标记抗体反应形成标记抗体－抗原复合物，未结合的标记抗体通过与固相抗原吸附剂反应除去，测定上清放射性。近年来，IR-MA法的发展极为迅速，由于它的突出优点（前述），越来越可能替代放射免疫分析法。根据其实验步骤，主要有以下几种类型。 （一）双抗体夹心法 此法采用固相抗体来代替经典的固相抗原的IRMA法，固相抗体先与待测物（或标准品结合），再与标记的另一抗体反应，形成固相抗体－抗原－标记抗体复合物，未结合的标记抗体留在溶液中被倾倒除去，测固相放射性如下式表示： 上式中的Ab1、Ab2分别为抗一个抗原上的二个抗原决定簇的单抗，SP示固相。例如，美国Biotecx公司生产的ACTH IRMA试剂盒，其Ab1是单抗ACTH氨基端的抗体， ﹡Ab2是单抗ACTH羧基端的抗体；CA125试剂盒，固相涂布抗体是McAb B27.1，放射标记的抗体是McAb B43.13。 （二）标记第三抗体法（标记双抗法） 标记第三抗体法，此第三抗体即为抗夹心法中的那个标记抗体的抗体，亦即双抗，这样设计是为了简化标记每一个特异性抗体，只要标记这个双抗体，即可作为通用示踪剂（125I标记兔抗老鼠IgG），如下式表示： 三）双标记抗体法 利用抗原有多个抗原决定簇，在单抗制备上可筛选出3个以上的特异性McAb，则其中一个可涂布固相上，其余两个均分别进行放射碘化标记，这样此复合物的比活度提高，有利于提高灵敏度和精密度，如下式表示： （四）IRMA－生物素－亲和素的测定系统（biotio-avidin system IRMA :BAS-IRMA） 1986年Willian D.Odell等首先在美国临床化学杂志发表生物素－亲和素系统引入IRMA法测定促甲状腺素获得满意结果的报告，接着有Zahradnik等和peters等分别发表引用BAS－IRMA法检测ACTH，CEA等成功的报告。 应用此法突出的特点是BAS具有放大的作用，使检测的灵敏度大大提高，目前一些超灵敏的IRMA试剂药盒就是应用此原理制成的. 其基本原理如下： 一个抗体IgG分子上，可以标记几十个生物素分子(一次放大)，因此凡有生物素衍生物的反应层就是一个放大级，亲和素由四个相同的亚基组成，中间经二硫建相连接，亲和素分子的每一个亚基都可以结合一个生物素分子，故呈现四价反应性，从而又产生新的放大效应(二次放大)。 生物素标记的IgG，在-20℃保存期2年不失活，本法的示踪剂是125I标记的链亲和素，可作为通用示踪剂，生物素和亲和素具有很高的亲和力，亲和常数Ka值达1015L/mol，较抗原－抗体反应高10～100万倍，且两者结合极为稳定，使测量的精密度也明显提高，如下式表示： （五）BAS在IRMA法中作为分离剂 本法基本原理是：一个具有多位抗原决定簇的抗原，一方面与生物素化单抗结合，另外又与放射标记的另一个单抗结合，反应结合后，投入试管内一粒亲和素包被的聚苯乙烯珠（珠的直径约8mm），在170rpm震荡器室温震荡2h，弃上清，用含有TritonX-100PBS洗二次塑料珠，测塑料珠放射性，如下式表示： 125I-Ab1 + Ag + B-Ab2 ?----- 125I-Ab1-Ag-Ab2-B----- 125I-Ab1-Ag-Ab2-B-A-SP BAS系统作为分离剂，其特点是克服了IRMA法多次离心洗涤的麻烦，其次由于亲和素与生物素结合更牢固，有可靠的稳定性。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析 * * 第七章 放射免疫分析技术和免疫放射分析技术 自从1959年Yalow和Berson创建放免以来，在方法学，以及相关技术都得到了大的发展： 一.随着放射免疫分析的问世，其它的标记免疫分析方法相继衍生和发展，如竞争蛋白结合分析，放射受体分析，酶联免疫吸附分析，时间分辨荧光免疫分析等。 二.传统的竞争性放射免疫分析逐步被非竞争性放射免疫分析所取代。 三.相关技术得到了发展。由于单克窿抗体的出现和应用，是传统RIA加速向非竞争性IRMA发展，同时分离剂和自动化检测也有更大的发展。 放射免疫分析技术（IRA）：其基本方法是放射性标记抗原和被测抗原（或标准品）对有限量的特异性结合剂（抗体）发生可逆性的竞争反应，最终形成放射性抗原－抗体复合物与被测物的含量呈逆相关，因而是微量或超微量的待测抗原进行定量检测的一种方法。 优点： 灵敏度高，特异性强，应用范围广，操作简便。 基本原理：标记抗原和待测抗原（或标准品）对有限量的特异性抗体发