洛阳地区汉族人群RHD基因杂合性检测及其临床意义-广州血液中心.PDFVIP

洛阳地区汉族人群RHD基因杂合性检测 洛阳地区汉族人群RHD基因杂合性检测 及其临床意义 及其临床意义 Determination of RHD zygosity in Han ethnic population in Luoyang and its clinical significance Determination of RHD zygosity in Han ethnic population in Luoyang and its clinical significance 河南省洛阳市中心血站 杨波 河南省洛阳市中心血站 杨波 2014.10.10 2014.10.10 关键词 关键词 RHD基因 （RHD gene ） Rhesus Box 杂合性 （zygosity ） PCR-SSP 前言 前言 在人类红细胞血型系统中，Rh血型最具多态性， 可以将其作为研究人类进化的一个遗传标志。目前 通过血清学方法已经鉴定出40多种抗原，其中RhD 抗原具有重要的临床意义，通过免疫反应产生的抗 -D可导致严重的新生儿溶血病（HDN ）、溶血性输 血反应等。随着分子生物学发展，编码D抗原的 RHD基因结构已经明了，而RHD基因杂合性正日益 成为研究热点。为了探讨洛阳地区汉族人群RHD基 因杂合性特点，我们收集了不同的RhD表型（RhD 阳性、弱D 、RhDel及RhD 阴性），检测RHD基因 的杂合性 材料与方法 材料与方法 1.样本来源：洛阳市中心血站无血缘关系的汉族无偿献血员 RhD 阳性样本300例，RhD 阴性样本56例，弱D型样本12例， RhDel型样本1 例。枸橼酸盐抗凝。为确保本研究的地域 特异性，要求所有献血员三代均在洛阳居住。 2.主要仪器与试剂：血型血清学专用离心机（日本 九保田）， PCR仪（ABI 9700 ），IgM型抗-D （上海血液生物医药有 限责任公司），人源性IgG型抗-D （上海血液生物医药有 限责任公司），IgG型抗-D （上海血液生物医药有限责任 公司），IgG型抗-D （法国 Diagast ）、DNA提取试剂盒 （北京康为世纪生物科技有限公司），PCR试剂盒（大连 Takara ），DNA Marker （大连 Takara ）。 材料与方法 材料与方法 3.RhD抗原鉴定：严格按试剂说明书操作。 4.Rh弱D型的鉴定：将与IgM型抗-D试剂血清学试验 阴性的样本红细胞与来自不同厂家的IgG型抗-D混 合，于37℃水浴45分钟，洗涤三次，加入抗人球蛋 白试剂，离心观察结果。若出现凝集，则为弱D 型；若未见凝集，则为RhD 阴性。 5.RhDel型的鉴定：取受检红细胞与等体积人源性IgG 型抗D抗体于37℃孵育1小时，洗涤三次后，用等 体积的三氯乙烯/氯仿（体积比1：1）混合物放散， 离心，间接抗球蛋白法检测放散液中是否含有抗D 抗体。如果放散液中含有抗-D，则为RhDel型。 材料与方法 材料与方法 6.全血基因组DNA 的提取：严格按试剂说明书 操作。 7.引物合成： 按照参考文献合成RHD基因 Rhesus Boxes引物。参照GeneBank上公布的 人类生长激素HGH （NM 022557.2 ）基因序 列，自行设计内对照引物，产物长度为 431bp 。引物序列见表1。所有引物均由上海 生工生物股份有限公司合成，TE Buffer稀释 成浓度为配为5 μmol/L应用液-20℃保存备 用。 引物名称