海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术-水产养殖专业论文.docxVIP

海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术 海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术 海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术 摘 要 弧菌广泛分布于近海及河口的海洋环境，已经证明有多种弧菌是鱼类的重要 条件性致病菌。弧菌病是引起全球水产养殖业病害泛滥、造成巨大经济损失的鱼 类细菌病。弧菌的致病机理与它携带几种重要毒力基因有关，这些毒力基因编码 不同的毒力因子，分别行使不同的功能， 共同协作形成一套复杂的致病机制。在 20世纪90年代发展起来的基因芯片技术， 是高通量、微型化和自动化的新型分子 生物学技术，是基因功能研究的有力工具。将该技术应用于水产动物病害监测， 进行快速有效的早期诊断对防治工作来说是很重要的。 采用十字交叉划线法、点种法和平板扩散法从160株海洋细菌中筛选出1株 对鳗弧菌和哈维氏弧菌的生长有一定抑制作用的海洋细菌2004103101。将病原菌 接种到2004103101菌的除菌培养上清中，设定对照组，通过在不同培养时间测 量培养液的OD600再次确认其培养上清中是否含有抑制病原菌生长的物质。结果 显示，这株菌对两种病原菌均有一定的生长抑制作用。2004103101菌革兰氏染色 阴性，弯曲短杆状，TCBS培养基上菌落呈半透明黄色湿润扁圆形，有较强的体 外溶血性，生理生化实验结果表明该菌与鳗弧菌相似。进一步对其16S rRNA的 序列进行PCR测序和构建系统发育树，结果显示2004103101菌与鳗弧菌自然聚 类，亲缘关系最近。综合上述结果可将2004103101菌鉴定为鳗弧菌。将这种拮 抗菌对大菱鲆进行腹腔注射感染实验，以注射鳗弧菌和海水鱼用生理盐水分别作 为阳性和阴性对照，经过14天的观察和结果分析，结果发现这株菌的毒力相对 于鳗弧菌而言是很低的。为进一步探讨其毒力损失原因，针对鳗弧菌的毒力表型 相关基因vail,empA,virC，virA,flaA和angM以及168 rRNA设计了7对PCR弓l 物，以鳗弧菌和2004103101菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，发现与鳗 弧菌相比较，2004103101菌缺失与表面抗原合成有关的virC基因，并且angM基 因扩增片断的数量和大小也与鳗弧菌有一定不同。angM基因是鳗弧菌质粒pJMl 和pEIBI所共有的，编码非核糖体多肽合成酶。 l 海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术利用基因芯片高通量、平行性的特点，选择针对各弧菌的16S 海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术 利用基因芯片高通量、平行性的特点，选择针对各弧菌的16S rRNA、hsp60 和2至6个不等的毒力相关基因，设计了由29个探针组成的寡核苷酸芯片和28 对基因特异性引物。利用国际生物技术信息中心网站 (http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／)进行每个基因序列的BLAST搜索和相关文献的 检索，检索到各基因的同源序列后，再将各基因与其同源序列用omiga软件进行 比对，找出保守区和特异区，分别处理保存后导入AllcldD 3．0软件或Array Designer 4．0软件，设计扩增产物片段长度为200—500bp的引物和长度为45·55bp 的探针。将设计好的探针再全部导入omiga软件进行比对，确定探针之间最多不 超过四个连续碱基相同，而且位置刚好处于引物扩增区，然后交由基因公司合成。 将合成后的探针按照设定的位置分布用手动点样仪点在尼龙膜上，经紫外交联后 固定在膜上组成寡核苷酸膜芯片。 用酚一氯仿抽提法提取细菌总DNA作为PCR的模板，然后用基因特异性引 物加入地高辛标记的dUTP扩增并标记各菌株的待测目的片段，标记后的PCR产 物用1％的琼脂糖凝胶电泳检查后测定标记产量，然后配制成20ng／ml的杂交液同 时与膜芯片进行杂交，对杂交时间、PCR产物浓度设计梯度试验以优化反应条件， 检测芯片的灵敏度。杂交结束后的反应信号用NBT-BCIP液显色后进行分析。 试验结果显示其中12个毒力相关基因均能特异性显色，无其它交叉反应， 可以作为菌株是否含有该毒力基因的检测方法，作为菌株是否致病的重要参考指 标，而每种弧菌的16S rRNA和hsp60探针点(共10个)则都会与其它一至三种 弧菌的16S rRNA、hsp60发生交叉反应(溶藻胶的hsp60除外)，其反应信号不 能作为菌种准确鉴定的依据，只能作为菌株是否是弧菌的鉴定依据。试验中溶藻 胶弧菌的omp、副溶血弧菌的自m、费氏弧菌的ampC在PCR反应中能很好的扩 增出单一的目的条带，但在杂交信号中没有出现显色反应。试验中费氏弧菌的omp 和enf,灿烂弧菌的aelv和vsm未能扩增出目的条带，因这些基因有菌株特异性， 说