第7章-基因工程载体.pptVIP

7.常用质粒载体 * * * * ⑴pBR322质粒载体 pBR322质粒载体的组成 含pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(ampr) 含有pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr) ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点。 * * pBR322质粒载体的优点 pBR322分子量较小,长度为4363bp的环状双链DNA。 pBR322具有2种抗菌素抗性基因,抗四环素基因(tetr)和抗氨苄青霉素基因(ampr),可供作为选择标志。 pBR322具有较高的拷贝数,15-20个/细胞，为重组体DNA制备提供了极大方便。 含有5个单一的限制性内切核酸酶位点。 pBR322 DNA被限制性内切酶消化后产生的片段大小已知道，可作为核酸电泳的分子质量标准。 * * * * pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 ⑵pUC质粒载体 pUC质粒在pBR322基础上改建的，其组成如下： 含有pBR322质粒的复制起点(ori)。 含有氨苄青霉素抗性基因(ampr)基因。 含有大肠杆菌?-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码?-肽链的DNA序列(即lacZ′基因)。 位于lacZ′基因中靠近5’端引入了一段有多克隆位点(MCS)区段,但它不会引起编码肽链功能的改变。 * * * * * * pUC质粒载体的优点： 具有较小的相对分子质量和更高的拷贝数，可达500-700个拷贝/细胞。 适用于组织化学方法检测重组体,有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的?-肽链可参与?-互补作用，在IPTG诱导和底物X-gal存在下，形成蓝色和白色菌落筛选重组体。 具有多克隆位点，便于目的基因克隆。 * * * * ⑶T-载体 8.质粒载体的用途 用于保存和克隆小于2kb的目的基因。 构建基因组文库和cDNA文库。 可用于目的基因的测序。 作为核酸杂交时探针的来源。 * * * * * * * * 噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。 三、λ噬菌体载体 * * λ噬菌体侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 λ噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。 λ噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原。 * * * * λ噬菌体的生活周期 1.λ-DNA载体的构建 1) 缩短长度 野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。 * * 2) 删除重复的酶切位点 野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个；同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点；除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。 * * * 第七章 基因工程载体 一、概 述 二、质 粒 载 体 三、λ噬菌体 载体 四、柯斯质粒 载体 五、酵母人工染色体 一、概 述 (一)基因载体的概念 基因载体:是指运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达的工具, 化学本质是DNA分子。 按来源分:质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体载体等。 按功能和用途分:克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌型表达载体。 按性质分：融合型载体、非融合型载体。 按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。 * * (二)基因载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 * * (三)基因载体具备的特性: ①载体能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制；或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制；在载体中插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。 ②载体易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。 ③载体都具有供外源基因插入的限制性内切核酸酶位点，即多克隆位点。 ④载体都具有能够观察的表型特征(遗传标记基因)，在插入外源基因后可作为重组DNA选