52 多聚酶链式反应扩增DNA片段[第二课时教案](高中生物选修一教案系列).docVIP

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 复习提问：①PCR扩增反应中加入引物和DNA聚合酶的作用分别是什么（07年广东高考）？生答：略 师总结：引物起的作用是结合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位点；DNA聚合酶的作用是从引物的3｀端开始催化DNA链的延伸。 ②由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链做模板时怎样延伸DNA子链？ 生答：与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸。 师：根据生物体内DNA复制与PCR技术的区别填写下表： DNA复制 PCR反应 解旋 解旋酶 热变性 引物 一小段RNA 一小段DNA或RNA（与DNA母链的一段碱基序列互补配对） 合成子链 在引物的作用下，一条链连续合成另一条链不连续合成 可以是RNA或单链片段，都是连续合成，控制温度72 特点 半保留复制 边解旋边复制 分别从两条链的引物端开始，在体外迅速扩增 循环次数 受生物体自身控制 30多次 T a q D N A聚合酶 不需要 需要 相同点 生物体内的DNA复制和PCR体外扩增都需要模板，四种脱氧核苷酸等，都需要一定的缓冲液和适宜的温度。 黑体字部分为学生自学完成。 随堂练习： 资料显示，近10年来，PCR技术(聚合酶链反应技术)成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制(如下图),在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答： (1) 加热至94℃的目的是使DNA样品的氢键断裂， 内是通过解旋酶的作用来完成的。 (2) 如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应加入两种特定的引物，当温度降低时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的3｀端连接脱氧核苷酸，两条子链延伸的方向都是5｀→3｀，而细胞内的复制是边解旋边复制，在解旋部位，一条从5｀到3｀方向的互补新链是沿着解旋方向向前合成的，但另一条从3｀到5｀方向的互补新链则先按照5｀→3｀方向一段一段合成DNA单链小片断（“冈崎片段”约1000-2000个核苷酸的长度），这此片断再由DNA连接酶连接起来，可见这条子链是倒退着合成的。 (3) 综合PCR技术与人体细胞内DNA合成过程可知，二者的必需条件中，除了模板、 原料、ATP、酶以外，至少还有3个条件，即：液体环境，适宜的温度和酸碱度，前者是由PCR仪自动调控，后者是靠缓冲液来维持。 (4) DNA的复制需要引物，其主要原因是（ D ） A、可加快DNA的复制速度 B、引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合 C、引物的5｀端有助于DNA聚合酶延伸DNA子链 D、DNA聚合酶只能从3｀端延伸DNA链。 (5) PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若 要检测一个人是否感染了艾滋病毒，你认为可用PCR技术扩增他血液中的 D A．白细胞DNA B．病毒的蛋白质 C．血浆中的抗体 D．病毒的核酸 引言：PCR扩增DNA程序是怎样的呢？ 引导学生阅读教材P62，完成学案：实验操作及操作提示 1、PCR反应体系总体积是0.5ml；其配方中成分包括扩增缓冲液； 4种脱氧核苷酸的等量混合液；引物Ⅰ；引物Ⅱ；水； TaqDNA聚合酶；模板DNA。 2、实验用具 （1）PCR仪：该仪器的自动化程度较高，按照设计程序，自动调控温度，可实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时要按程序在3个水浴锅中来回转移。 （2）微量离心管：是一种薄壁塑料管，微量离心管实际上是进行PCR反应的场所 （3）微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头要用一次换一次。 操作步骤 (1)准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上。PCR手忙脚乱的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用的扩增缓冲液;缓冲液实验前应分装成小份，并在-20℃，储存，使用前将其从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化备用。为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 （2）移液：用微量移液器按照PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分。 （3）混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀。 （4）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s ，目的是使反应液集中到离心管底部。 （5）反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 思考： ⑴、PCR循环过程中，预变性温度设置94℃ 答：增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 ⑵PCR循环过程中，变性温度设置94℃ 答：变性温度过低，解链不完全导致PCR失败；变性温度过高对酶的活性有影响；此温度条件下如果时间过