家蚕核型多角体病毒基因p24的功能研究-细胞生物学专业论文.docxVIP

浙江理工大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 浙江理工大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得浙江理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年月 日 万方数据 学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江理工大学可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印成扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：你绿 签字日期：沙侈年乡月7占日 导师签名： 矮 签字日期： 只弦日 万方数据 本研究由 本研究由 浙江省生物学“重中之重学科 国家高技术研究发展计划“863”项目 (No．20 1 1 AA 1 00603) 提供资助 万方数据 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学硕士学位论文 家蚕核型多角体病毒基因p24的功能研究 摘要 P24是一种重要的核衣壳相关蛋白，其基因p24在杆状病毒生活史中所发挥的作用 以及在细胞中的功能少有人研究，本实验选取BmNPV为载体对该基因进行深入研究。 本实验首先扩增出含有Bmp24基因同源臂的打靶片段，利用Red重组技术实现了打靶 片段与目的基因之间的替换，进而成功构建了Bmp24缺失型病毒并命名为 Bmp24．ko．Bacmid；然后构建重组转移载体pFastBacHTB-p24，利用Bac．to．Bac系统将 该Bmp24定点补回到缺失型Bacmid的多角体启动子下游，成功构建了Bmp24补回型 Bacmid并命名为Bmp24．re．Bacmid。 为了研究Bmp24在细胞中的调控功能，实验将缺失型病毒(Bmp24．ko．Bacmid)、补 回型病毒(Bmp24．re．Bacmid)及野生型病毒(wtBacmid)等量转染到正常的家蚕卵巢细 胞(BmN)当中。病毒滴度测定结果显示3种病毒的转染都能够引起细胞发病，即都可 以产生有感染力的子代病毒。通过滴度值得比较，发现Bmp24缺失型病毒的滴度值显著 低于野生型和补回型病毒(PO．05)。为了进一步了解Bmp24对病毒颗粒包装的影响， 收集感染48h后的细胞进行透射电镜分析，电镜结果显示Bmp24缺失型病毒感染的细胞 中只有少量细长的杆状结构，但在野生型病毒感染的细胞当中出现大量包装成熟的病毒 颗粒。透射电镜显示缺失Bmp24仍然可以包装子代病毒，但对包装为成熟的病毒粒子有 显著影响，与滴度测定结果一致。 为了研究Bmp24的缺失对病毒基因组复制的影响，实验选取了ODV的囊膜蛋白结 构基因Bmgp41为代表基因，进行qPCR分析。实验结果显示随着3种病毒基因组转染 时间的延长，Bmgp41的拷贝数均增加，但各时相Bmgp41的拷贝数无显著差异。为了 研究Bmp24的缺失对病毒基因组转录水平的影响，实验选取了BmNPV中非常具有代表 性的3个基因进行RT-qPCR，分别是病毒早期基因Bmlef-3、晚期基因Bmvp39和极晚 期基因BmplO。RT-qPCR实验结果显示，相对于野生型病毒，Bmp24的缺失会显著降低 子代病毒基因组中Bmlef-3、Bmvp39和BmplO的转录水平(尸D．05)，但Bmp24的补 回可以弥补这一现象。综上所述可知，Bmp24基因的缺失对子代病毒基因组的复制水平 没有显著影响，即是病毒复制的非必需基因；缺失Bmp24基因的Bacmid仍然可以产生 万方数据 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学硕士学位论文 家蚕核型多角体病毒基[]p24的功能研究 有感染力的BV粒子，说明Bmp24基因不是BV形成的必需基因；但Bmp24的缺失会 降低子代病毒的感染力，说明Bmp24对BV的感染力有一定影响。RT-qPCR结果说明 Bmp24基因缺失会降低病毒基因组早期、晚期以及极晚期基因的转录水平，即Bmp24 的缺失对病毒基因转录水平有一定影响。 为了进一步研究该基因的性质，本实验将目的基因Bmp24克隆到原核表达载体 pET-28a(+)上，在大肠杆菌BL．21(star)中诱导表达带有6xHis标签的融合蛋白，大 小约为24．8KDa，与预期一致。通过Ni柱纯化获得BmP24并进行BCA定量，通过免疫