CE分离件的优化方法.ppt

毛细管电泳分离条件选择策略 概 述 毛细管电泳分离条件选择的内容很多，且与样品、分离模式、检测方式、进样方法乃至仪器系统结构等相关，但有许多共同之处，这里将对普遍性的问题进行考察，包括毛细管电泳模式选定、仪器操作条件确定、介质选择等。 毛细管电泳模式的选定 毛细管电泳有许多不同的模式，因而在分离样品前必需很好选择分离模式，以达到最佳的分离结果。毛细管电泳模式的选择，可以有不同的原则，比如简单性、目的性、普适性、选择性、样品特异性等。 毛细管电泳模式的选定 以简单性为原则时，所选分离模式的操作、条件优化、分离控制等必需是最简单和最容易的，而且富于后续变化。根据这一道理，首先应该考虑自由溶液分离模式，最后才考虑填充形式的分离模式。简单性原则是毛细管电泳模式选择的一般规则。 毛细管电泳模式的选定 在分离生物样品时，通常需要根据分离的目的来选择分离模式：欲测定样品的尺寸，就须选NGCE或CGE，偶可选用CZE或MEKC；要测定样品的等电点，则应选用CIEF；在进行亲和作用研究时，则应当首先选用ACE。 毛细管电泳模式的选定 我们的分析目的可能并不是单一的，这时的分离模式选择，就应该注意考虑其通用性。CZE、MEKC 和 CEC 的通用性和可调节性都较大，但根据简单性原则，还以 CZE 或 MEKC 为优。注意，填充型毛细管电泳不适合于颗粒样品的分离，甚至也不适合于大分子分离。 毛细管电泳模式的选定 有时，我们会特别注重分离的选择性，即只希望把目标组分分离出来。此时应优先考虑选择性高的分离模式，如ACE等。如果已知样品的某些特性，也可以据此选择分离模式，比如在分离蛋白质和多肽等两性样品时，可以优先考虑CIEF；在分离中性分子时，优先考虑MEKC；在分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式等。 毛细管电泳模式的选定 实际样品五花八门，性质各异，分离模式的选择是可变的和灵活的。 这种灵活性恰好与毛细管电泳模式间的易换性相吻合。 基本操作条件选择 这里所谓的操作条件包括： 电泳电压、温度、毛细管尺寸、进样 方法、检测条件等，下面分别讨论之。 电 泳 电 压 理论和实验均表明，效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作电压。在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，则极大电压可能会超出仪器的控制范围，此时没有最佳电压，可选用仪器允许的最大输出电压。当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压有可能很小，若此时的分离度很高，也可以选择大于极大值的电压进行分离。 电 泳 电 压 极大电压可以利用理论计算或实验测定来获得。利用理论效率方程，通过求极值的方法可以确定极大电压。理论计算过程往往繁琐，而且也不很可靠，通过实验测定来确定工作电压其实非常简单。根据欧姆定律，电流和电压具有线性关系，如能测定电压与电流的关系曲线就不难确定工作电压。 电 泳 电 压 方法如下： ①在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压）； ②做电压～电流曲线； ③取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在150～400V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏。 电 泳 电 压 除工作电压选择外，还应考虑电压施加方式的选择。理论上，毛细电泳可有恒流、恒压、恒功率、梯度升（降）压分离等不同的工作方式。目前，绝大多数分离采用瞬间升压的恒压工作方式。实际上，采用恒流工作方式有利于提高分离的重现性，在没有良好恒温控制的系统上进行电泳时，建议采用恒流或恒功率操作。经验表明，采用升压（升流）分离，可以有效提高分离度，有条件时，应当充分考虑线性升压的工作方式。在微量制备研究中，还需要考虑降压分离过程，以便于馏分的准确收集。 电 泳 温 度 电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制和分离介质对温度的限制等因素。热效应控制旨在避免管内溶液因过热而出气泡或沸腾，显然温度越低越好；重现性控制意在避免温度波动；分离效率控制的目的在于提高分离度，依据样品性质的变化而高低不等，需由实验来测定。此外，某些介质对工作温度有一定的限制，比如凝胶介质不能适应忽高忽低的温度变化，也不宜在过高或过低的温度中电泳。 电 泳 温 度 多数情况下，在20～30℃之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。如若不然，便需