鸡鸭感染H9N2亚型禽流感病毒后的免疫应答差异研究-微生物学专业论文.docxVIP

摘要摘 摘要 摘 要 鸡和鸭两者同属于鸟纲，均为禽流感病毒(AIV)的天然宿主。通常鸡对 AIV较易感，特别是感染高致病性禽流感病毒(HPAI)后有明显的临床症状和 很高的死亡率：鸭在感染HPAI后通常也不会表现出明显的临床症状，因此成为 了病毒的“特洛伊木马”而到处传播病毒。在过去的50年中，对于鸡的研究比 较广泛，已有很多试剂可用。但由于鸡和鸭的很多基因保守性较低，导致很多适 用于鸡的试剂无法与在鸭的研究中使用。故对于鸭的免疫系统研究相对滞后。 本研究根据NCBI数据库中鸭CD3e(dCD38)、CD4(dCD4)和CD80【(dCD8a) 基因序列设计引物，分别扩增出了全长为537 bp、1449 bp和714 bp的开放阅读 框(ORF)。在此基础上，扩增基因去除信号肽序列的胞外区片段构建pET重 组表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)5b进行表达。SDS．PAGE和Western blot鉴～ 定结果显示：在大肠杆菌中得到成功表达的重组dCD3e(rdCD3e)、dCD4(rdCD4) 和dCD8a(rdCD8a)胞外区蛋白的分子量大小分别约为33 kDa、45 kDa和23 kDa。 将镍柱变性纯化的蛋白作为抗原，免疫BALB／c小鼠分别制备抗rdCD3e、 rdCD4和rdCD8a的单克隆抗体(mAb)。Western blot检测结果显示，所有分泌 抗体的细胞上清均能与相应的重组蛋白发生反应。通过间接免疫荧光(IFA)进 一步筛选鉴定识别内源性的mAbs，分别获得了2株(4H3、1C3)能稳定分泌抗 dCD3emAb的细胞、4株(1A11、1F7、2D7和3F12)能稳定分泌抗dCD4mAb 的细胞和1株(5E4)能稳定分泌抗dCD8a mAb的细胞。激光共聚焦结果显示， 这些mAbs所结合的dCD3e、dCD4和dCD8a蛋白均表达于鸭外周血单个核细胞 (PBMC)的细胞膜表面。这些结果显示，我们成功获得了抗鸭CD3e、CD4和 CD80【的单抗。 以制备的mAbs为工具，利用流式检测技术对鸭CD3、CD4和CD8的表型 细胞进行了分析，结果显示：CD3e+细胞在PBMC中占69．7％、在脾单个核细胞 (SMC)中占57．51％、在胸腺细胞中占58．84％、在法氏囊细胞中为01 CD4+ 细胞在PBMC中占37．56％、在SMC中占30．05％、在胸腺细胞中占51．6％、 在法氏囊细胞中为01 CD8a+细胞在PBMC占45．17％、在SMC中占50．86％、 在胸腺细胞中占69．9％、在法氏囊细胞中占34％。分别用fluor 488、PE和APC V 浙江，：。jjl冉Jj学位论文 浙江，：。jjl冉Jj学位论文 抵要 对抗鸭CD3e、CD8a及CD25单抗进行标记。多色流式分析表明，PBMC中CD4一 和CD8+T细胞分别约为27％和33％，CD25分子的表达约占4％和8％的CD41。 T细胞和CD8+T细胞；SMC中CD4+和CD8+T细胞分别约为37％和40％，CD25 分子表达于约占5％和11％的CD4+T细胞和CD8十T细胞；胸腺细胞中CD4+和 CD8+T细胞分别约为67％和55％，CD25分子表达约占4％和3％的CD4+T细 胞和CD8+T细胞。这些结果首次揭示了鸭PBMC、SMC、胸腺细胞及法氏囊细 胞中免疫细胞的生理分布。 以H9N2 AIV(106 EID5do．1mL)感染30日龄无H9N2血清抗体的SPF来 航鸡和番鸭。攻毒后不同时间分别处死接种和对照组动物，采集抗凝血、血清、 脾脏、胸腺和法氏囊进行分析。流式细胞分析显示，CD4+T细胞仅在鸭胸腺细 胞中具有显著的增长，之后处于下调状态，在两者的PBMC和SMC中则没有明 ～显的上调，甚至略有下调。鸭CD8+T细胞在PBMC、SMC和胸腺细胞中有显著 的上调，鸡的CD8+T细胞仅在PBMC中有显著上调，且持续时间较鸭短。有趣 的是，鸡、鸭的CD8+CD25+T细胞在感染过程中呈现了显著的上调趋势。这不 仅提示CD8+T细胞在H9N2 AIV感染过程发挥了重要功能，而且也说明 CD8+CD25+T细胞参与了H9N2 AIV感染过程的调节。Quantitative real time PCR 结果显示：Toll样受体(TL飚)在感染早期在鸭中的表达较鸡更显著。促炎性 因子几．1p、IL．6和IL．17在鸭外周免疫系统PBMC、脾脏中的表达较鸡更为显 著，而在中枢免疫系统胸腺和法氏囊中的表达较鸡而言则受到了显著的抑制。 MHC I类和II类分子在鸡中有更为显著的表达。Till型细胞因子几．2在感染早 期在鸭中的表达更为显著，而到后期则多受到了抑制，而儿．18则在鸭胸腺和法 氏囊中的表达更为显著，在脾脏中的表达则