04 实验四 植物DNA的提取及纯度浓度鉴定.pptVIP

植物DNA的提取与鉴定 实验四 实验原理 真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内 在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白 实验原理 ①在核蛋白溶液加入氯仿－异戊醇，振荡，使蛋白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质。 ②用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出DNA。 ③用苯酚处理，然后离心分层，蛋白变性后则停留在酚层内。 ① 化学因素 核酸在pH4.0～11.0稳定， 否则就变性降解。 ② 物理因素 DNA是长链线状分子，强机械作用会使DNA分子断裂。 ③ 酶的作用 DNA酶会降解DNA分子。 紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度 核酸的紫外吸收峰260nm,蛋白质280nm DNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.0 1ug/mL的DNA溶液,吸光度A260=0.020 1ug/mL的RNA溶液，A260=0.022-0.024 1.0个A260相当于50ug/mL的DNA,40ug/mL的RNA。 实验步骤 10mL CTAB分离缓冲液加入50mL 离心管中，在65℃水浴中预热。 取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。 将约1g叶片粉末加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动混匀，65℃保温30分钟。 加10mL氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。 室温，4000 rpm离心10分钟。 用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来 用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至10mL 70％乙醇中，浸泡洗涤10分钟 用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥 将DNA沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液中 DNA纯度和浓度鉴定 取100uL DNA溶液（剩余的DNA溶液放在-20℃保存），用TE缓冲液稀释20，50和100倍，测定A260和A280 根据A260/A280判断DNA纯度 计算提取的DNA总量 试 剂 CTAB分离缓冲液 2% CTAB （十六烷基三甲基溴化铵） 1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA 100 mmol/L Tris-HCL(pH8.0) 0.2% 巯基乙醇 CTAB CTAB（十六烷基三甲基溴化铵） 阳离子去污剂,它不仅能使蛋白质变性，还能与核酸形成特异的核酸－CTAB复合物。 核酸－CTAB复合物可溶于≥0.7mol/L NaCl的高盐缓冲液。 异丙醇 氯仿-异戊醇（24：1） 液氮 70%乙醇 TE 缓冲液 10mmol/L Tris-HCL （pH7.4） 1mmol/L EDTA 思考题 本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？ 吸取样品、抽提应注意什么？为什么？ 提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？ * * * * 在浓氯化钠溶液（1～2 mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小。 在稀氯化钠溶液（0.14 mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。 利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。 去除蛋白质的方法 破坏DNA完整结构的因素 * *