基因芯片载体的表面化学处理及核酸固定技术研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

博士学位论叉 博士学位论叉 基因芯片载体的表面化学处理及核酸固定技术研究 基因芯片载体的表面化学处理 及核酸固定技术研究 博士研究生：吴清华 指导教师：马文丽教授 摘要 近年来，在固相载体上固定核酸(寡核苷酸，eDNA，PCR产物等) 分子来制各DNA微集阵列(DNA-microarray)是制作基因芯片或微型 化杂交阵列的关键技术之一，已成为了一种重要的生物学和医学的研 究工具，广泛应用于基因突变检测与多态性分析、疾病监测与反义药 物筛选、基因表达变化监控等领域。 核酸的固定化是基因芯片制各首先需要解决的问题。在此过程中 需要对载体表面进行化学处理，从而有效地将各种核酸探针特异、快 速和稳定地固定在所修饰的表面。它直接影响微阵列的性能，在芯片 的制各中起着关键的作用。因此，对该领域的研究与开发，将有助于 促进我国基因芯片大规模自主生产和应用。 核酸固定技术是涉及到表面化学、分子生物学的交叉学科，主要 包括物理吸附和化学偶联(共价连接)两大类。在传统的固定技术中 多以物理吸附为主要方式，存在着表面活性差、连接效率低、稳定性 差等缺陷。本研究将共价连接方法引入玻片的表面处理和核酸的固定 中：改进了经典的多聚赖氨酸(poly—L—lysine)包被法．自行研制研究了 两种基于多组分多氨基化合物连接系统和丙烯酸一丙烯酰胺聚合物系 中文摘要统的芯片表面； 中文摘要 统的芯片表面； 将它们应用于入噬茵体全基因组基因芯片和 SARS。CoV冠状病毒寡核苷酸芯片的制备与检测；利用阵列引物延伸 技术将优化的芯片表面用于p5 3基因的SNP检测。具体研究包括以下 过程： 1．多聚赖氨酸偶联的优化：在原有poly．L—lysine表面处理基础 上，在玻片表面偶联上多聚赖氨酸聚合物分子层。这些聚合物涂层以 共价键连接在玻片表面，经PDITC交联剂活化后，能将寡核苷酸以共 价键结合的形式固定在玻片上。在此表面制备了寡核苷酸芯片，检测 其固定效率、杂交效率、重复利用性和稳定性等重要指标，结果表明 各项性能均优于传统的poly．L。lysine芯片表面。 2．网状聚合物分子层的表面修饰：为了克服玻片平整致密的表面 结构使其探针上样量有限、生物分子连接效率差的缺点，研制研究了 两种不同的方案对玻片进行表面化学处理，一种是在玻片表面衍生树 状分支的多组分多氨基化合物连接系统(Poly．Amine表面)，另一种是 在玻片表面聚合上具有溶胀性的网格状聚合物分子层丙烯酸一丙烯酰 胺聚合物系统(AACA．Copolymer表面)。利用表面化学反应将富含氨 基的化合物或聚合物以共价键方式连接到预先硅烷化的显微载玻片 上，然后利用官能团交联分子活化玻片表面，使DNA能快速、稳定地 结合在玻片上。通过对固定效率的检测获得了两种芯片表面上最适合 的固定探针浓度、长度和种类。杂交点阵的荧光信号强度高、背景低， 杂交点圆润、同一性好，适合不同长度的未修饰寡核苷酸芯片的制备， 其中AACA．Copolymer玻片的制备流程更简单。 3．DNA芯片和Oligo芯片的检验研究：将所研制的两种玻片进一 步应用于DNA芯片和寡核苷酸芯片的制备与检测，并在杂交过程中采 用限制性荧光标记技术来进行检测，考察其通用性。1)将研制的 Poly—Amine和AACA—Copolymer表面用于九噬菌体全基因组芯片的制 备：采用了P CR扩增法收集实验所需的探针，制备九噬茵体全基因组 博士学位论文 博士学位论文 基黉芯片栽体磁表函纯学处理及糠酸固定技术研究 芯片，用限制性荧光标记技术对九噬菌体全基因组待测样品进行标记、 杂交和检测；2)按照寡核苷酸探针设计原则，设计并合成了l 2条60mer 的SARS—CoV寡核营酸，并将其固定在所研制的玻片上，制备了SARS 冠状病毒寡核苷酸芯片，利用限制性荧光标记技术对VeoE6细胞培养 的SARS—CoV样品标记后与芯片杂交、检测。实际应用表明， Poly。Amine玻片和AACA。Copolymer玻片在芯片制作中通用性好，探 针固定效率高，检测灵敏性好q同时与Corning公司和Telechem公司 的商业化芯片表面进行了比较，进一步证实了所研制芯片表面的性能。 4。SNP s p53芯片的原位延伸技术研究：在研制的优化 AAC A。Copolymer玻片上，以K5 62细胞为研究对象，应用寡核瞢酸阵 列弓l物延伸法对p 5 3基因进行SNPs的平行检测。根据寡核苷酸基因 芯片上延伸引物的设计原则设计出挖条p5 3基因第三外显子上的SNP 检沏0的延伸引物，点样制备成寡核苷酸基因芯片，将巢式PeR扩增出 的p5 3基因片段与芯片杂交，在DNA聚合酶(Klenow Fragment)的 介荨下进行荧光标记的单碱基延伸反应、洗脱、扫描巷同时p5