课件：激光扫描共焦显微镜技术的应用.ppt

* * * * * 激光扫描共焦显微镜应用 功能. 1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集 2.无损伤、连续光学切片，显微“CT” 3.真正的三维重组 4.假三维图的显示 5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切 6.定量分析 7.时间序列扫描: xyt 、xyzt 和 xt 扫描 8.图像处理 9. 旋转扫描 10.感兴趣区域扫描 11.光谱扫描 激光扫描共焦显微镜应用 应用 定位、定量 三维重组 动态测量 ? 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) ?自由基的检测 ?药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 ?蛋白质的转位 激光扫描共焦显微镜应用 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量 线粒体膜电位的测量 荧光漂白恢复（FRAP）的测量 笼锁解笼锁的测量 荧光能量共振转移（FRET）的测量 其他应用 激光扫描共焦显微镜应用 一、定位、定量 免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量：如：细胞膜受体或抗原的分布， 微丝、微管的分布、 两种或三种蛋 白的共存与共定位、蛋白与细胞器的 共定位、核转录因子转位和干细胞的 增值、分化 细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位杂交-fitc + PI 荧光原位杂交： 染色体基因定位 激光扫描共焦显微镜应用 定位、定量研究中常用荧光探针 1.Amine-Reactive Probes 与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (异硫氰基荧光素) (四甲基异硫氰基罗丹明) Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻红蛋白) Texas Red 595/615 (德州红) Cy3 558/568 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618 激光扫描共焦显微镜应用 1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免役荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗体+荧光探针) 肌动蛋白actin ( Palloidine+荧光探针) 2)细胞膜表面受体 配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2) 标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC 激光扫描共焦显微镜应用 2.标记细胞器荧光探针 1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子, 可检 测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留 时间短 JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检