基因工程化的系膜细胞系移植在体外及体内监测急性肾小球肾炎-外科学专业论文.docxVIP

中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果．据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意． 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签 名’宏竺一立=经莎莨 日期：盘塑篁姿鱼炱 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学 校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 办撕 厂+—。。—’““’—。。—。。—。、{ 厂+—。。—’““’—。。—。。—。、 { 中文论著摘要 j 基因工程化的系膜细胞系移植在 体外及体内监测急性肾小球肾炎 研究背景与目的 肾小球肾炎是慢性肾衰的常见原因之一。目前，没有一种手段能够连 续性地、无侵袭性地评估肾小球肾炎。单核巨噬细胞系统在很多种类的肾 小球肾炎的发病中都起重要作用1 o在病理条件下，活化的巨噬细胞释放出 一系列的炎症介质，导致肾小球损伤的起始和进展2 o监测巨噬细胞一系膜 细胞间相互作用对于评估肾小球肾炎的活性和明了肾小球损伤的机制是很 重要的。我们将KB增强子片段引导的分泌性碱性磷酸酶(SEAP)稳定地 导入系膜细胞。本研究的目的在于确定这个建立的系统能否在体外监测巨 噬细胞一系膜细胞间的相互作用；将这个系膜细胞系移植到大鼠体内后，它 能否在体内监测局部的肾小球炎症。 方 法 克隆系膜细胞系SM43是从雄性SD大鼠的肾小球分离的9 o动物实验 全部采用清洁级成年雄性SD大鼠(日本山梨大学医学部动物部)o主要仪 器设备：Gene Light 55荧光照度仪，超净台，C02细胞孵育器，CR582离心 机，BAS一2500型放射自显影机，电泳仪。主要试剂有SEAP检测试剂盒， 抗一Thy 1．1单克隆抗体1—22—311，pNFKB—SEAP质粒。主要药物有IL 一1 13,TNF一仅和MGl32。 首先进行转染，将pNFKB—SEAP质粒(5斗g)和pcDNA3．1质粒(1 肛g)转染5 X 105个SM43系膜细胞。上述质量与0．25M的CaCl2400一混 合，短时间快速振荡，之后与2xBBS400止混合并振荡30分钟到1小时，直 到出现肉眼可见的沉淀物后，在4。C条件下放置约2到3小时。随后将混 合液转入上述培养皿内并搅拌。约16小时后，更换培养液；24小时后，用 浓度是330 pg／ml的G418(一种新霉素)来选择稳定的转染细胞，可引导性 1 最高、背景影响最小的—个克隆被选出，以进行下面的细胞实验。我们将该 最高、背景影响最小的—个克隆被选出，以进行下面的细胞实验。我们将该 克隆命名为SM／NFKB—SEAP5 o使用同样的方法，用pSEAP2一对照质粒 和pcDNA3．1质粒，我们又建立了SM／SV—SEAF28。细胞系o pSEAP2一对 照质粒编码SV40早启动子和增强子引导的SEAPo本实验仅使用稳定转 染的20代到35代细胞。 建立大鼠肾炎模型：在成年雄性SD大鼠(体重250—300克)，将1 ml 单克隆抗体1—22·3经尾静脉注入，建立抗一Thy 1．1肾小球肾炎模型。 筛网法分离肾小球：将正常大鼠或肾炎大鼠(抗体注入后第4天)的肾 脏很好地研碎J序列地通过j三个不锈钢筛网，筛网的孔径直径分别是180、 125、106恤hi．然后帚,q--4E PBS收集肾小球。 细胞移植：1×106个已经贴壁生长的SM／NFKB—SEAP5细胞被胰蛋白 酶解离，放在lml含1％FBS的培养液内，4。C放置。大鼠右侧卧位，经左侧 腹壁打开腹腔，分离出肾门血管，经左肾动脉将细胞注入到正常或肾炎大鼠 (肾炎后第一天)的肾脏内o 肾小球肾炎的体内监测：将大鼠分为5组：1．正常大鼠、2．移植了感受 细胞的正常大鼠、3．肾炎大鼠、4．移植了感受细胞的肾炎大鼠、5．腹膜细胞 移植组。第1、3、6、8和lO天从