几种鳞翅目昆虫几丁质酶基因的克隆与表达研究-作物遗传育种专业论文.docx

摘 摘 要 摘要 昆虫儿r质酶cDNA序列可以转化植物或者插入到病原微生物(如Bt或杆状病毒)中 并使之表达，增加杀虫效果。对昆虫几丁质酶基因cDNA序列的克隆、表达等一系列分子 生物学研究将为生产这类生物杀虫剂奠定重要的理论基础，为害虫的生物防治开辟新的途 径。 甜菜夜蛾、粘虫、玉米螟、二化螟四种昆虫均是重要的农业害虫，每年给农业生产都 造成一定程度的损失，对这些害虫的生物防治宣采用以苏云金芽孢杆菌为主的多种生物杀 虫剂的综合使用的策略。由于昆虫几丁质酶所具有的潜在杀虫活性，可以利用上述昆虫的 几丁质酶与苏云金芽孢杆菌的协同杀虫作用来有针对性地增强对甜菜夜蛾、粘虫、玉米螟 和二化螟的杀虫效果，并且希望通过此途径有效地避免这些害虫抗性的产生。 本实验从预蛹期甜菜夜蛾、粘虫、玉米螟、二化螟四种昆虫体内各分离克隆了一条儿 丁质酶基因序列，序列长度分别为2838、2810、3343、2237个碱基，分别包括一个1674、 1677、1662和1659个碱基的的开放读码框，编码557、558、553、552个氨基酸，分子量 分别为62 6、62．8、61．8和61 4 kDa，等电点分别为5 2，5．05，5．28和5．17。 由四种害虫几丁质酶核苷酸序列推导的氨基酸序列为多结构域序列，包括Ⅳ-端的活性 催化区(Catalytic domain)，C增≈富含半胱氨酸的几r质结合区(Chitin．binding domain 2)。 序列比对表明，在催化区中含有两个高度保守的区域，一个是KFMvAvGGwAEGs，另一 个是yDFDGu)LDwEYP．而第二个高度保守区是酶的催化活性中心区。在催化区和几_J 质结台区中间有一个被称为Linker的富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸的区域(PEST rich domain)。除了几丁质酶催化区、几丁质结合区和Linker区外，在克隆的昆虫几丁质酶 ～．端成熟蛋白的前端还都禽有一个疏水性、大约在20个氨基酸左右的信号肽。 昆虫几丁质酶是一种糖蛋白，糖基化对酶的活化是至关重要的。Linker区一般要经过 O．位的高度糖基化修饰，而在催化区也会有部分Ⅳ-位糖基化修饰。利用NetOGlyc 2．0软件 发现在甜菜夜蛾几丁质酶氨基酸序列中有23个O-位糖基化位点，粘虫几丁质酶氨基酸序列 中有21个O．位糖基化位点，而玉米螟和二化螟几丁质酶氨基酸序列中均具有29个O．位糖 基化位点。Ⅳ_位糖基化修饰的位点数目也是不一样的，甜菜夜蛾、粘虫和玉米螟3种昆虫 几丁质酶氨基酸序列中存在2个Ⅳ_位糖基化位点，二化螟几丁质酶氨基酸序列中存在3个 ‘v_位糖基化位点。除O．位和Ⅳ．位糖基化位点以外，昆虫几]质酶氨基酸序列中还存在多个 硫酸化和磷酸化位点，这些位点可以通过Expasy分子生物学服务器上的Prosite软件找到， 它“J的存在对于蛋白功能的发挥均起到一定的作用。 通过NCBI上的Blast软件比较分析，甜菜夜蛾几丁质酶氮基酸序列与烟草天蛾几] 质酶氨基酸序列同源性达到81％，与棉铃虫几丁质酶氨基酸序列同源性达到87％，与斜纹 夜蛾几丁质酶氨基酸序列同源性达到96％，与美国自蛾几丁质酶氨基酸序列同源性达到 83％，与其他鳞翅目昆虫几丁质酶氨基酸序列同源性达到也达到75％以上。其他3种昆虫儿 r质酶氨基酸序列与已经发表的昆虫几r质酶氨基酸序列进行比较也得到了类似结果，说 明我们克隆得到的序列是编码昆虫几丁质酶的cDNA的序列，是四种新的昆虫几r质酶基 明我们克隆得到的序列是编码昆虫几丁质酶的cDNA的序列，是四种新的昆虫几r质酶基 闻，其中玉米螟和二化螟JL丁质酶基因是首次克隆的鳞翅目螟蛾科昆虫几丁质酶基因。 四种昆虫几丁质酶基因cDNA序列已经分别命名为Sechi，Mechi，Ofchi，Cschi，在 GenBank上的登录号分别为AY658731，AY508698，AY726548，AY705930。 利用大肠杆菌和酵母表达系统对甜菜夜蛾和粘虫的儿r质酶基因分别进行了表达。削 Novagen公司的大肠杆菌pET表达系统和Biolab公司 Impact表达系统对甜菜夜蛾和粘虫几 J‘质酶基因进行了表达，结果pET系统表达的外源蛋白分子量为80kDa，是以没有活性的包 汹体的形式存在，而Impact系统表达的细胞内蛋白分子量为l 16 kDa(包括55 kDa Intein tag)， 町以通过超声波裂解进入到上清中，形成可溶性蛋白。同时利用毕赤酵母表达了甜菜夜蛾 』j j+质酶基因，表达的产物约为75 kDa，可以直接进入培养基上清液中，形成分泌型表达。 对大肠杆菌pET系统表达的昆虫几丁质酶包涵体蛋白进行了变性和复性研究，得到了可 溶性的几丁质酶蛋白。 以LOEWE公司的carboxymethy