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生物化学实验课件 概 述 通过实验课，掌握比色、层析、电泳等基本实验方法的原理和操作技能，学会选择正确的方法进行生物材料中多种物质的分离、提纯及鉴定。 通过实验加深对生物化学基本原理的理解。 实验内容 蛋白质的两性性质和等电点测定 3 蛋白质含量测定（考马斯亮兰） 4 酶的基本性质 5 转氨酶活性鉴定（纸层析法） 6 淀粉酶活力测定 6 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 6 质粒的提取、电泳 6 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 (综合性实验) 50 实验时间：双周，第二周开始！ 要求： 勤于动脑、善于动手！ 参考书目 生物化学实验技术 郭蔼光 郭泽坤 主编 高等教育出版社 生物化学实验方法与技术 陈毓荃 主编 科学出版社 蛋白质的两性性质和等电点测定 1.实验目的 1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。 2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。 2.实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可解离基团除N-端α-氨基与C-端 羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Phe、Thr、Ser的 羟基、Cys的巯基、Arg的胍基、His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基和 Lys的ε-氨基等都能解离为带电基团。 在蛋白质溶液中存在着下列平衡： 阴离子 两性离子 阳离子 pH＞pI pH = pI pH＜pI 电场中： 移向阳极 不移动 移向阴极 调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。 在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大。配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等电点。在pH梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据此可分离等电点不同的蛋白质。 2.1氨基酸的两性解离和等电点 2.1.1 氨基酸的两性解离 在一定pH值时，氨基酸以兼性离子存在，在电场中不会向正、负酸极移动，此时的pH值称氨基酸的等电点（pI）。 pI= 1/2 (pK1’ +pK2’) 酸性氨基酸 pI= 1/2(pK1’ +pKR’) 碱性氨基酸 pI= 1/2(pK2’ +pKR’) 2.2 蛋白质的两性电离及等电点 2.2.1蛋白质的两性电离 蛋白质是由AA组成的高分子化合物，具有许多游离的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巯基、酚基等，因此与AA一样，能象酸一样解离，也能象碱一样解离，也是两性电解质。 当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等，即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电点(isoelectric point)。 3.仪器、试剂和材料 4. 操作步骤 具体参见实验指导书 5. 结果处理 用－、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。 6. 注意事项 缓冲液的pH值必须准确。 7. 思考题 1）解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。 2）该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？ 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法） 1.实验目的 1）通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理。 2）了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。 2.实验原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在0~1