第七章固定化酶-课件.ppt

第七章 固定化酶 内容 酶的固定化的优缺点 固定化酶的研究历史 酶固定化方法 固定化酶的性质及影响因素 固定化酶的定义 在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 缺点： 酶活力损失； 增加了酶的成本； 只适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底物，对大分子不适宜； 不适宜于多酶反应。 选择载体 应考虑： 载体的形式：薄片状、管状、纤维状、颗粒状等； 载体的结构：孔型、半透膜性和非孔型； 载体的性质：水溶性和水不溶性； 酶偶联量或装载量和实效系数。 酶固定化方法 酶固定化时遵循的原则： 维持酶的催化活性和专一性； 固定化应有利于自动化、连续化反应； 固定化酶应具有最小的空间位阻； 酶与载体必须牢固结合； 固定化酶应具有最大的稳定性； 固定化酶易与产物分离； 固定化酶成本要低； 充分考虑固定化酶在制备工程和应用中的安全因素。 载体材料 无机（inorganic） 天然有机（organic from natural sources) 合成有机（organic synthetic materials) 非化学结合法 结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法。 分散法：将酶分散于水不溶相中而实现固定。 超滤反应体系 离子结合：酶通过离子键结合具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶等。使用注意：pH、离子强度、温度 物理吸附 通过氢键、疏水键、电子亲和力等物理作用 选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。 缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制 影响酶在载体上吸附程度的因素 pH值:影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附； 离子强度:多方面的影响，盐阻止吸附； 蛋白质浓度:若吸附剂的量固定，随蛋白浓度的增加，吸附量也增加，直至饱和。 温度:蛋白质往往是随着温度的上升而减少吸附； 吸附速率:蛋白质在固体载体上的吸附速率要比小分子慢得多； 载体:非多孔性载体，颗粒越小吸附力越强。 离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等 。 固定化方法：条件温和，操作简单，在一定pH，T、离子强度下，酶液与载体混合搅拌几个小时/酶液流过处理好的离子交换柱，获得固定化酶。 应用：制备过程中，活力损失较少。但是，离子键结合力较弱，结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。在酶催化反应时，要控制好pH、离子强度和温度等条件。 吸附法的优点 不发生化学反应，对酶活影响很小，无副作用。 固定化操作简单，条件温和， 容易再生，吸附剂可反复使用。 缺点： 作用力弱，容易泄漏，污染产物， 载体非专一性结合其他物质 被吸附的酶要过量，酶损耗大 解决途径： 开发新的载体 根据载体的性质对酶进行适当的化学修饰，以增加吸附力 酰氯酰化反应 共价结合法的几个影响因素 载体亲水，具有较好的机械强度和稳定性，同时具有能在温和条件下与酶结合的功能基团； 偶联反应的反应条件必须在温和pH值、中等离子强度和低温缓冲溶液中； 所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少； 要考虑到酶固定化的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。 共价结合法优点： 结合牢固，固定化酶的稳定性好，利于连续使用，不会因为反应条件等原因轻易脱落，应用和报道最多的一种方法。 缺点： 反应条件苛刻，操作复杂， 引起高级结构变化，破环活性中心，不易得到比活力高的固定化酶，酶活回收率30%， 底物专一性会发生变化。 磁性颗粒载体固定化 微粒（纳米粒子和微米粒子） 微囊（核壳结构） 膜（平板和中空纤维） 酶固定化载体的仿生设计、制备：借鉴酶在生物体中的存在形式 1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降 原因：酶结构的变化、 空间位阻 2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高 操作过程中长时间保留活力 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 固定化增加了酶的耐热性 大多数固定化酶都具有较高的热稳定性。以氨基酰化酶为例 固定化增大了酶对变形剂、抑制剂的抵抗能力 酶固定化后可以增强它们对蛋白质变性剂如尿素和盐酸胍的抵抗能力，而且有些酶在变性剂存在的情况下，酶活力反而升高，这可能是这些变性剂增大了酶的柔顺性。 固定化可以延长酶的操作和保存有效期 渗透压稳定剂 为防止制备得到的原生质体破裂，应加入适当的渗透压稳定剂，如无机盐、糖类、糖醇等