基于转录组测序的中华鳖微卫星标记的开发及MSTN基因的克隆表达-水生生物学专业论文.docxVIP

基于转录组 基于转录组测序的中华鳖微卫星标记的开发及 MSTN 基因的克隆表达 中文摘要 中文摘要 中华鳖（Pelodiscus Sinensis），隶属于爬行纲（Reptilia）、龟鳖目（Testudinata）、 鳖科（Trionychidae）、鳖属（Pelodiscus），其肉质鲜嫩、风味鲜美独特，自古以 来就是深受消费者喜爱的滋补珍品。近年来随着生活水平的提高，中华鳖的消费 量呈逐年上升趋势，其养殖规模也逐年扩大。然而自上世纪九十年代以来，由于 大量境外走私鳖涌入我国，加之各养殖场间相互引种、和近亲繁殖，导致中华鳖 的种质性状出现退化，严重影响了中华鳖产业的可持续发展，因此种质保护和良 种选育是中华鳖养殖产业亟待解决的重要课题。为此本文采用转录组测序技术， 开发了与生长性状相关的中华鳖 EST-SSR 标记，分析了与经济性状关联的基因位 点，并对中华鳖四个不同养殖群体的遗传结构和遗传多样性进行了分析；开展了 中华鳖 MSTN (Myostatin) 基因的克隆及表达分析，为寻找挖掘中华鳖生长性状相 关基因的分子结构和功能，及其遗传育种等工作奠定了一定的科学基础。主要研 究结果如下： 1 基于中华鳖转录组测序的 EST-SSR 标记的开发、验证 根据中华鳖转录组测序获得的文库序列，通过 MSATCOMMANDER 来检索全 部非冗余 unigenes 中的 SSR 位点，并通过 PRIMER3 软件来设计 PCR 引物，再根 据基因注释及 GO 二级分类的结果，挑选分类中生长（growth progress）、增殖 （reproduction progress）、代谢（metabolism progress）三个 GO 二级分类条目中 isogene 上的 SSR 位点所设计的 100 对引物，进行多态性的验证，从中筛选得到了 15 对多态性引物，对太湖鳖、日本鳖、黄河鳖、淮河鳖 4 个中华鳖养殖群体进行 基因扫描、种群遗传结构分析和多样性检测。统计各个微卫星位点的等位基因频 率（P）、等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂 合度（He）、哈德温伯格平衡 PHW、多态性信息含量 PIC。同时，采用 MEGA3.2 软件绘制基于 Nei 氏标准遗传距离的 UPGMA 系统进化树。分析统计结果如下： ①中华鳖转录组测序组装和拼接后共得到 85246 条 unigenes，其中在 15319 个 （17.97%）unigenes 中共检索到 19452 个 SSR 位点，微卫星分布的频率和密度分 I PAGE PAGE IV PAGE PAGE III 中文摘要 基于转录组测序的中华鳖微卫星标记的开发及 MSTN 基因的克隆表达 别是 22.82% 和 177 per Mb，共有 11801 个位点（61%）被成功设计获得引物，从 三个 GO 二级分类条目上的 isogene 上的 SSR 位点中随机筛选设计的 100 对引物， 经过验证，23 对表现为多态性。 ②15 对引物对四个中华鳖群体 120 只个体进行基因扫描共得到 354 个等位基 因，每个位点得到的等位基因数从 2 至 7 个不等，平均等位基因数为 2.95，平均 有效等位基因数为 2.46；平均观测杂合度为 0.40，平均期望杂合度为 0.55，平均 多态性信息含量为 0.48，达到中度多态水平（0.5P0.25）。 ③黄河鳖与日本鳖之间遗传距离最大（0.157），遗传相似系数最小（0.8547）， 说明两者亲缘关系较远; 黄河群体与淮河群体遗传距离最小（0.0841），遗传相似 系数最大（0.9194），说明两者亲缘关系较近。聚类分析结果表明：黄河鳖和淮河 鳖先聚为一支，然后与太湖鳖聚合，最后才与日本鳖聚合。 2 中华鳖 EST-SSR 标记与生长性状关联性分析 采用中华鳖转录组测序开发的 15 对多态性 EST-SSR 引物，对 60 只中华鳖的 体长、体重、背甲长和裙边宽 4 种生长性状进行标记-性状相关性研究，结果表明： C8387 位点分别与体长、体重、背甲长和裙边宽显著相关（P0.05）和极显著相关 （P0.01），CC 型、AB 型分别为 4 种性状的优势、劣势基因型；C211 位点分别 与体重、背甲长和裙边宽呈极显著相关（P0.01）和显著相关（P0.05），其中等 位基因 C 与体重呈负相关，CC 型是裙边宽、背甲长性状的劣势基因型，而 BB 型 和 AB 型分别是裙边宽和体重的优势基因型；C5670 位点与体重和背甲长分别呈极 显著相关（P0.0