质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告.docVIP

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法： 染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度； A260/A280=1.8 DNA纯净 A260/A2801.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A2801.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。 质粒DNA的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。 琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、材料与方法： （一）实验材料： 1.PCR 仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒DNA的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管 材料：溶液 P1（S1）、溶液P2 (S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α 3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法） 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4.质粒DNA的酶切鉴定 仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪 材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 （二）实验方法 准备目的DNA：菌液煮沸10min 准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液 取0.2?ml?PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入： 取0.2?ml?PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物1 (10 mol/L) 1μl、引物2 (10 mol/L) 1μl、菌液5μl