基因重组蛇毒纤溶因子rFⅡ的理化性质和溶栓作用的初步研究-药理学专业论文.docxVIP

中山大学博士学位论文 中山大学博士学位论文 摹凼重组蛇毒纤溶网子rFIl的理化十芈质和浒拴作用的初步研究 基因重组蛇毒纤溶因子rFII的理化性质 和溶栓作用的初步研究 专业：药理学 博士生：江伟健 指导教师：颜光美 教授 摘要 蛇毒是毒蛇头部毒腺所分泌的有毒液体，它是一种生物毒素biotoxin)。蛇 毒中含有二十种以上的活性成分，其中主要成分为神经毒素、多肽和酶类等生物 物质，因此蛇毒具有多种生物效应，尤其在神经系统和心血管系统方面。本实验 室利用基因工程技术，从尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)毒腺中分离得到了 种 蛇毒纤溶酶的eDNA序列。本论文运用生物信息学、分子生物学、蛋白质化学和 生物化学等方法对这种新的蛇毒纤溶酶进行了研究，为蛇毒纤溶酶溶栓作用、结 构与功能的研究及抗血栓新药的开发和利用奠定了基础。 应用生物信息学工具对蛇毒纤溶酶的氨基酸序列进行分析后发现，本论文所 研究的蛇毒纤溶酶属于一种锌金属蛋白酶，与前人所报道的一个锌金属蛋白酶 Reprolysin序列高度相似。 利用基因工程的手段，构建了蛇毒纤溶酶的表达质粒，在真核表达系统酵母 菌中获得了高效表达。试验中通过离子交换和疏水层析，最终获得了高纯度的重 组蛇毒纤溶因子。分析纯化的重组蛇毒纤溶因子的物理性质，发现通过激光飞行 时问质谱测定的分子量与通过预测得到的分子量相差O．7 kDa，推测可能跟翻译 后的修饰有关。圆二色谱分析结果表明，纯化的重组蛇毒纤溶因子的二级结构中 以G一螺旋(or-helix)和B一拐角(13-turn)为主，含部分无序(Random)结构，不 含有p一折叠(D—sheet)。其二级结构的组成与天然提取的蛇毒纤溶酶的二级结构 基本一致，说明通过重组表达得到的蛇毒纤溶因子的折叠是正确的。 中山大学博十学位论文 中山大学博十学位论文 基因重纽蛇毒纤溶明予rFll的理化件质和溶栓作用的韧步研究 在体外，利用酪蛋白、发色底物、Azocasein对重组的蛇毒纤溶因子rFIl进 行了酶学性质的研究。结果表明，rFlI对发色底物N一(p—Tosyl)-Gly·Pro—Lys 4-pNA 的Km值是5．36×104 mol／L，如，值是4．18x104 S一。酶反应的最佳温度和pH值 分别是30．50℃和pH 7．0一10．5。EDTA和PMSF均可抑制rFII的蛋白水解活性。 高浓度的铜离子和锌离子对rFll的蛋白水解活性有抑制作用。rFll对酪蛋自的水 解呈时间和浓度依赖性的趋势。应用胰岛素氧化B链为底物检测rFII的酶切位 点，结果提示其酶切位点为Vall2 GluB、LeuILTyrl6和Phe24．Phe25。 对基因重组蛇毒纤溶因子rFlI的体外溶栓作用研究表明，rFll对纤溶酶原没 有激活作用，rFII可以水解纤维蛋白原和纤维蛋白的d链、B链、Y链，水解程度 随作用时间和酶浓度的增加而增加；对纤维蛋白的酶切位点不同于纤溶酶。利用 比浊法研究了rFII对血小板聚集功能的影响，结果显示rFIl在体外可以抑制ADP 诱导的人血小板聚集，抑制作用与rFII之间存在着量效关系，50％的抑制浓度 [C50为85．6 gg／mL。 总之，重组蛇毒纤溶因子rFII在真核表达系统中获得了高效的重组表达：纯 化的rFII的活性研究及其溶栓能力的研究对于阐明rFII的酶学活性意义重大， 同时也为开发一种新的治疗血栓性疾病的药物提供重要的参考数据。 关键词：尖吻蝮蛇，重组蛋白，纤溶蛋白(原)溶解酶，蛇毒 II 中山大学博七学位论文 中山大学博七学位论文 基因重组蛇毒纤溶阁下rFIl的理化性质和溶栓作用的初步研究 Studies of the characterization and the fibrin(ogen)olytic activity of a novel recombinant snake venom proteinase Major：Pharmacology Name：Jiang Wei-jian Supervisor：Prof．Yah Guang—mei Abstract Snake venoms contain a great variety of different proteins that are toxic．These components mediate their toxicity by either stimulation or inhibiting the hemostatic system of human victims or experimental animals，resulting in common clinical com