植物生理学 实验3_NR活性测定.pptVIP

实验二 问题分析 气孔密度 （单位）：固定法比印迹法多 气孔大小（开度）：Na+可以代替K+，但效果较差 取样时间、位置及照光时间 实验三 硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶活性的影响 硝酸盐还原 硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase)催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。 诱导酶(induced enzyme)植物体本来不含有，但在特定的外来物质(如底物)的影响下诱导形成的酶 NO3－的还原在根或叶中均可进行 NO3－供应少时，主要在根中还原 NO3－供应量大而根中还原力不足时， NO3－运到叶片进行还原 亚硝酸盐还原为氨 亚硝酸还原或在根中的前质体，或在叶中的叶绿体中进行。 还原所需的电子来自还原态的铁氧还蛋白。 NO3-还原为NO2-后，NO2-被迅速运进质体即根中的前质体或叶中的叶绿体，并进一步被亚硝酸还原酶（NiR）还原为NH3或NH4+。 一 实验目的 理解硝酸还原酶的特性； 掌握硝酸还原酶活性测定方法。 实验原理 在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。 NO2-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中磺胺与NO2-形成重氮盐，再与α-萘胺偶联形成红色的偶氮化合物，可用分光光度计在540nm下比色测定。 三 材料与方法 两种处理的小麦材料[水（W）， KNO3 （N）] A液 磷酸缓冲液：水：DNP溶液：蔗糖溶液＝ 5：5：1：1 B液 磷酸缓冲液：KNO3：DNP溶液：蔗糖溶液＝ 5：5：1：1 磺胺试剂 α-萘胺试剂 四 实验步骤 两种材料[水（W）， KNO3 （N）]各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、擦干，剪成0.5 cm小段，各称取0.3克两份； 将两份（W、N）叶段分别置于含有10 ml A、B溶液的两只试管中，即WA、WB， NA、NB四管(每个试管塞蓝色纱网)； 将试管放在真空干燥器中抽气0.5h，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； 将试管置于25-30℃温箱中黑暗保温0.5h； 取四支试管，标号为WA′、WB ′ ， NA ′ 、NB ′，分别吸取1ml对应反应液，各加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂（注意顺序），混合摇匀， 25℃水浴5min，取出室温静置25min。 再取两支试管分别取A液或B液1ml代替反应液，各加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂。设空白对照管在540 nm测定吸光值。 表 硝酸还原酶的活性 六 思考题 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？ 七 注意事项 摇晃直至叶段沉于溶液中（试管内放入滤网） 磺胺试剂和 α-萘胺试剂（加入时注意顺序） 加入磺胺和α-萘胺后要混合摇匀，静置30分钟 分光光度计使用 （测定之前注意波长） * * NR基因表达的调控 实验证明NO3-能诱导NR的表达 叶绿体 叶绿体中，还原反应所需的一对电子由还原态铁氧还蛋白提供 NR是诱导酶，在取样前一天用50mM KNO3- 或NaNO3-加到培养苗的水中以诱导硝酸还原酶的产生。 NO2-产生 NO3- +NADH+ + H+→ NO2- +NAD++H2O 外界溶液中的NO3-渗入植物组织后，经硝酸还原酶作用，所产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中； 测定反应溶液中NO2- 含量的增加，即表现该酶活性的大小。 NH2 NO2-含量测定 NO2-含量测定 当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系。 NO2-含量标准曲线： [ NO2- ] （μ Mol / ml）= 0.0026＋0.359OD540 硝酸还原酶活性测定 NR酶活性（ NO2- μMol/h?gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml÷（鲜重g×0.5h） H2O KNO3 处 理 A 液 B 液 吸光度 吸光度 ODB-ODA NR活性 结果记录、计算 [ NO2- ] （μmol/ml）= 0.0026＋0.359OD540 酶活性（ NO2- μmol/h?gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml÷（鲜重g×时间h）