家族性肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓泛素表达特征-神经病学专业论文.docxVIP

ffI|JIIJ ffI|JIIJ IfIIrlflIlffJI II rfl l I I rll 』Y1 90 1 1 99 目 录 中文摘要 1 英文摘要 4 研究论文家族性肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓泛素表达特征 前言丹IJ吾 一88 材料与方法 8 结果 ．1 8 附图 ．20 附表 ．．25 讨论 ^ 26 结论 ．29 参考文献 29 综述肌萎缩侧索硬化相关的胞浆包涵体 ．．33 致谢 46 个人简历 ．47 中文摘要家族性肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓泛素表达特征 中文摘要 家族性肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓泛素表达特征 摘 要 目的：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)．是一种 进行性加重的神经系统变性疾病，选择性损害脊髓前角的运动神经元、脑 干运动神经核运动神经元及大脑运动皮层的大锥体细胞，表现为进行性加 重的肌肉无力、肌肉萎缩、肌束震颤、腱反射亢进，病理征阳性，最终呼 吸衰竭死亡。90％,--一95％的ALS为散发性，5％～10％的ALS为家族性， 约20％的家族性ALS与Cu／Zn超氧化物歧化酶(SODl)基因突变有关。 目前该病发病机制尚不清楚，但残存运动神经元中存在泛素阳性包涵体是 ALS的重要病理特征之一。 泛素是真核细胞中普遍存在且序列高度保守的小分子球形蛋白质，其 分子量约8．5K Da，由76个氨基酸残基组成，能够共价结合细胞中的受 体蛋白。泛素与泛素活化酶El、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、去泛素 化酶、蛋白酶体及其底物(蛋白质)构成泛素一蛋白酶体系统 (ubiquitin．proteasome system，UPS)。UPS是细胞内蛋白质降解的主要途 径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。大量研究认为UPS在错误折叠 蛋白或其他突变蛋白的降解过程中也发挥重要作用。泛素蛋白酶体降解通 路失调可导致异常蛋白在细胞内积聚，并进一步引起细胞功能紊乱及变 性。UPS功能异常可以发生于UPS途径的任何一个环节，如泛素化过程 中泛素量的失衡，泛素结合过程中泛素活化酶El，泛素结合酶E2，泛素 连接酶E3功能失调，蛋白酶体降解水平失调或去泛素化水平失调等。实 验表明，在ALS包涵体中所见的泛素连接酶Dorfm能特异性结合并泛素 化各种突变的SODl，对野生型SODl无影响。过量的Dorfin可减少SODl 包涵体的形成，从而保护神经元免受SODl毒性的损害。因此，泛素蛋白 酶体降解系统和ALS的发病可能存在密切关系。 本实验应用家族性肌萎缩侧索硬化动物模型(SODlG93A转基因小鼠) 观察泛素在ALS病程不同阶段的表达情况，旨在探讨泛素蛋白在ALS的 发病中的作用。 方法：饲养繁殖家族性肌萎缩侧索硬化动物模型SODlG93A转基因小 中文摘要鼠，参考Weydt，P．的描述将SODlG93A转基因小鼠分为症状前期(60天)， 中文摘要 鼠，参考Weydt，P．的描述将SODlG93A转基因小鼠分为症状前期(60天)， 症状早期，终末期。对照组动物为实验组小鼠同窝非转人突变SODl基因 小鼠。 1 10％水合氯醛350mg／kg腹腔注射麻醉后，心脏灌注4％多聚甲醛固 定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定．48h，梯度酒精脱水，二 甲苯透明，石蜡包埋，常规组织切片(59m厚)。59m厚的石蜡切片应用 免疫组织化学SP的方法显示泛素在SODlG93A转基因小鼠不同时期脊髓 前角细胞的表达分布形式。 2 10％水合氯醛350mg／kg腹腔注射麻醉后，新鲜取小鼠脊髓腰段， 液氮速冻，．80。C储藏，提取总蛋白用蛋白免疫印迹的方法检测泛素在 SODlc汐3A转基因小鼠不同时期腰段脊髓的表达量的情况。 3 10％水合氯醛350mg／kg腹腔注射麻醉后，新鲜取小鼠脊髓腰段， 液氮速冻，．80。C储藏，提取RNA反转录后，扩增目的基因用PCR的方 法检测泛素基因在SODIc汐3A转基因小鼠不同时期脊髓前角的转录表达情 况。 4计量资料用X+S表示，采用SPSS 13．0统计学软件对数据进行统计 处理。SODlG93A转基因小鼠不同时期组与对照组泛素转录mRNA水平及 蛋白表达水平的总体比较采用单因素方差分析。尸O．05为差异有统计 学意义。 结果： 1泛素免疫组织化学染色结果显示，对照组小鼠不同年龄阶段腰段脊 髓前角神经元均有泛素表达，无明显差别。SODlc93A转基因小鼠随病情进 展，泛素阳性蛋白表达逐渐聚集，形成泛素阳性聚集体。 2 SODlG93A转基因小鼠的腰髓总蛋白免疫印迹结果显示，随着病情进 展8．5K Da的单泛素及分子量17K Da以上的多聚泛素蛋白水平表达无明显 增加(尸=O．241，1．972，尸O