家族性开角型青光眼致病基因筛查与功能研究-眼科学专业论文.docxVIP

家族性开角型青光眼致病基因筛查与功能研究 家族性开角型青光眼致病基因筛查与功能研究 摘要 家族性开角型青光眼致病基因筛查与功能研究 中山大学中山眼科中心 专 业： 眼科学 博士研究生： 魏雁涛 导 师： 葛坚教授 摘 要 目 的 青光眼是以进行性视神经变性和视野缺损为特征的一类综合症，位列全球第 二位不可逆性致盲眼病。随着我国人口结构老龄化，开角型青光眼的发病率逐渐 增加，严重威胁患者视功能，对个人和社会均造成巨大损失。原发性开角型青光 眼发病机制尚未阐明。目前普遍观点认为原发性开角型青光眼为遗传异质性疾病， 遗传因素在POAG的发病机制中起到关键作用。迄今为止已定位了6个POAG相 关染色体位点，鉴定出两个开角型青光眼相关致病基因：TIGR／MYOC(trabecluar meshwork．inducible glucocorticoid response)基因和OPTN基因(optineurin)。 1999年葛坚教授课题组首先报道了一个典型、完整的原发性开角趔青光眼大 家系(GZ．1家系)。该家系具有家族聚集性、地域封闭性、遗传稳定性、临床特 征性等特点，具备青光眼分子遗传学研究的独特优势。 本研究应用全基因组扫描和基因测序法证实TIGR／MYOC基因为家族性开角 型青光眼家系的致病基因，该家系中nGR／MYOC基因存在Pr0370Leu和 Ar9169Gly两种突变型，进一步本研究利用体内外基因转染技术，对Pr0370Leu 和Ar9169Gly突变型TIGR／MYOC基因进行体内外功能研究，试图解读 TIGIt以ⅥY0c基因的致病机制，旨在通过揭示这一典型青光眼家系独特表型背后 的遗传本质以及疾病发生、发展的过程，为原发性开角型青光眼发病机制的研究 提供线索。 家族性开角型青光跟致病基因筛查与功能研究 家族性开角型青光跟致病基因筛查与功能研究 摘要 方 法 1．利用全基因组扫描、单倍体型分析以及基因测序方法对GZ．1家族性开角型青 光眼家系的致病基因进行定位筛查： 2．正常人眼小梁细胞的体外培养和鉴定：从角膜移植后剩余组织取材，利用组织 块培养法，进行小梁细胞体外培养，并利用光镜、电镜、细胞免疫组织化学法鉴 定小梁细胞； 3．突变型TIGR／MYOC基因真核表达载体的构建：在野生型TIGR／MYOC基因 真核表达载体的基础上，利用定点突变技术，分别构建Ar9169Gly和Pr0370Leu 突变型TIG刚MY0c基因真核表达载体； 4．野生型以及突变型TIGR／MYOC基因真核表达载体体外转染小梁细胞：利用 脂质体转染体外培养的小梁细胞，分别检测野生型以及突变型TIGR／MYOC蛋白 在细胞内外的表达量及其亚细胞器定位，细胞骨架蛋白．肌动蛋白和纽蛋白的形态 与分布，小梁细胞迁移能力，内质网分子伴侣．PDI和GRP78、基质金属蛋白酶的 表达；并利用Hochest染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡情况； 5．野生型以及突变型TIGR／MYOC基因真核表达载体体内转染：利用阳离子聚 合物(PEI)介导野生型以及突变型TIGR／MYOC基因体内转染小梁网，分别于转 染后1d，3d，7d，14d进行小梁组织病理学切片、免疫组织化学、透射电子显微 镜检测小梁组织的结构改变。 结 果 1．经全基因组扫描、单倍体型分析以及基因测序方法证实，GZ．1家族性开角型 青光眼家系的致病基因定位于l号染色体的TIGR／MYOC基因，TIGR／MYOC基 因存在Pr0370Leu和Ar9169Gly两种突变型； 2．体外成功培养正常人眼小梁细胞，并获得Pr0370Leu和Ar9169Gly突变型 TIGR／MYOC基因真核表达载体； 3．经Westem blot分析检测证实，培养上清液中突变型TIGR／MYOC蛋白的细胞 外分泌较野生型明显减少； 4．荧光免疫组化证实野生型TIGR／MYOC蛋白在小梁细胞内呈点状、弥漫、散 II 家族性开角型青光眼致病基因筛查与功能研究 家族性开角型青光眼致病基因筛查与功能研究 摘要 在分布；Ar9169Gly突变型TIGR／MYOC蛋白的分布向核周集中，与内质网高度 重叠；而Pr0370Leu突变型TIGR／MYOC蛋白是以大小不等、分布不均的积聚体 形式存在于胞浆内； 6．RT-PCR以及westemblot分析结果显示Ar9169Gly突变型转染组GRP78和PDI 表达较对照组、野生型TIG刚MYOC基因转染组轻度升高： 7．野生型以及突变型TIGR／MYOC基因对小梁细胞功能的影响 (1)突变型TIGR／MYOC基因转染小梁细胞中微丝束粗大并向胞膜处边集，纽 蛋白在核周的分布明显减少，而在胞膜处的分布则变得不连续、不规则、呈散在 点状； (2)划痕实验结果显示突变TI